孤束核在針刺調節(jié)大鼠血壓及胃腸感覺和運動中的作用.pdf

1、《靈樞·海論》“夫十二經脈者，內屬于府藏，外絡于肢節(jié)”的記載，說明溝通臟腑與體表肢節(jié)的聯系是十二經脈的重要功能。針刺通過刺激人體體表的穴位以達到治療內臟疾病調節(jié)內臟功能的作用。現代臨床研究顯示針刺治療心血管、胃腸等各種內臟疾病效果顯著，并有一定的穴位特異性。
　　針刺對內臟功能的調節(jié)是由脊髓及脊髓上中樞協同完成的。針刺引起的體表-內臟反射是其調節(jié)心血管、胃腸等內臟功能的重要神經反射形式，可分為脊髓固有反射及脊髓上反射兩種形式。體表

2、-自主神經反射分為體表-交感和體表-副交感反射兩種，由器官的自主神經支配特性和刺激部位的脊髓節(jié)段性決定，同時受刺激強度和種類的影響。孤束核(nucleus of tractus solitary，NTS)位于延髓背側，是迷走神經感覺傳入的第一級中樞，參與心血管、呼吸、胃腸等多種內臟功能的調控，也是心血管壓力感受性反射、胃腸感覺的第一級感覺中繼站：同時NTS與迷走神經背核、延髓尾端腹外側核(rostral Ventrolateral Me

3、dtdla，rVLM)、延髓頭端腹外側核(caudal Ventrolateral Medulla，cVLM)、疑核等中樞核團有纖維聯系，通過交感和副交感神經傳出通路完成對內臟功能的調節(jié)。
　　針刺調節(jié)內臟功能，常見單一穴位或依據傳統穴位配伍的多穴調節(jié)一臟的報道。例如內關對心血管功能的影響，足三里對胃腸功能的作用。未涉及穴位選取的規(guī)律性總結。本研究根據哺乳動物皮膚，肌肉，內臟神經分布的節(jié)段性特點，結合體表刺激引起軀體一植物神經反射

4、的前期研究報道，探討不同節(jié)段穴位，不同刺激方式引起的內臟植物神經反射的規(guī)律，力求從動物實驗總結出針刺對特定內臟功能進行交感樣和副交感樣調節(jié)的規(guī)律。本研究通過電生理學方法在中樞鑒別出NTS與心血管、胃腸等內臟功能及結直腸擴張(colorectal distention，CRD)刺激相關的神經元，同時記錄甲均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)、胃運動，選取不同神經節(jié)段的穴位進行針刺刺激，觀察不同穴位對MAP和胃運

5、動的影響，并同步觀察NTS與血壓調節(jié)、胃運動、CRD刺激相關神經元放電活動，研究NTS在降壓、調節(jié)胃運動和抑制CRD誘導內臟痛中的作用。
　　1針刺對MAP的影響及NTS與血壓調節(jié)相關神經元在針刺降壓中的作用
　　1.1實驗目的:
　　研究針刺對正常麻醉大鼠MAP、靜脈注射去氧腎上腺素(phenylephrine，PE)，硝普鈉(sodium nitroprusside，NP)分別引起升壓甲臺期、降壓平臺期時MAP的影

6、響，并同步觀察NTS與升壓(hypertensive related neurons)、降壓反射相關神經元(hypotensive related neurons)在針刺調節(jié)血壓時放電活動的變化，探討NTS中與升壓、降壓反射相關神經元在介導針刺降壓中的作用。
　　1.2實驗方法
　　本課題所有研究的動物實驗過程均遵守美國國立衛(wèi)生院倡導的實驗動物保護和使用指導原則(Guide for Care and Use of Labor

7、atory Animals，NIH)，實驗過程中對動物的處置遵照科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》規(guī)定。
　　實驗選用健康成年Sprague-Dawley雄性大鼠81只，體重300～380g之間，用10％的烏拉坦腹腔注射麻醉(urethane，1.0～1.2g/kg體重)。手術及實驗中動物體溫用動物恒溫系統維持在37℃左右。大鼠麻醉后進行頸動、靜脈插管、氣管插管，并暴露延髓后，監(jiān)測動脈血壓和心率，同步記錄MAP及NTS神

8、經元放電，在微電極推進器下，找到自發(fā)放電穩(wěn)定的NTS神經元，經靜脈推注30s左右PE(4μg/kg)、NP(NP，20ug/kg)，以判斷該神經元對升壓反射、降壓反射的反應及鑒別出與升壓反射和降壓反射相關神經元。對升壓反射和降壓反射相關神經元，待自發(fā)放電穩(wěn)定、MAP恢復至正常后，記錄30s放電脈沖數作為對照值，分別電針(波寬500ms，10Hz，1mA)“耳穴心”、“內關”、“足三里”各30秒。為排除針刺穴位順序對神經元放電結果的影響，

9、穴位針刺順序隨機選擇，觀察對MAP及血壓調節(jié)相關神經元放電的影響。然后在大鼠頸靜脈微量注射PE(6～12μg/kg，10-15min)或者NP(60～80μg/kg，10～15 min)分別造成藥物性血壓升高、藥物性血壓降低模型各15min左右，在升壓平臺期、降壓平臺期再分別電針上述穴位，并觀察對動脈血壓和NTS神經元放電的影響。
　　1.3實驗結果
　　1.3.1 NTS與血壓反射相關神經元的鑒別
　　麻醉大鼠頸靜脈

10、注射PE，完整記錄120個NTS細胞放電(細胞記錄不完整者不做統計，下同)，其中70個細胞(58.3％)放電頻率無變化；26個細胞(21.7％)放電頻率減少，呈抑制反應；24個細胞(20.0％)放電頻率增加，呈興奮反應。
　　麻醉大鼠頸靜脈注射NP，完整記錄101個NTS細胞放電，其中52個細胞(51.5％)放電頻率無變化：29個細胞(28.7％)放電頻率減少，呈抑制反應；20個細胞(19.8％)放電頻率增加，呈興奮反應。

11、　　1.3.2電針刺激對麻醉大鼠生理狀態(tài)下MAP及NTS神經元放電活動的影響
　　電針“耳穴心”和“足三里”能夠明顯降低實驗動物的MAP，與此同時，NTS與升壓、降壓反射相關神經元的放電明顯增加。電針“內關”雖然也能輕度激活NTS神經元放電，但對MAP沒有明顯影響。統計結果表明，正常血壓狀態(tài)下，電針“耳穴心”使動物的MAP由100.11±3.3mmHg下降為88.47±3.75mmHg，下降幅度為11.64±0.45 mmHg(P

12、<0.001)；電針“足三里”使MAP下降了5.74±0.64 mmHg(P<0.001)，電針“內關”對MAP無顯著影響。不同穴位組間降壓效應比較顯示，電針“耳穴心”、“足三里”對正常MAP的影響大于“內關”(P<0.05)。
　　針刺不同穴位引起MAP變化，同時影響正常生理性血壓狀態(tài)下NTS與血壓反射相關神經元的放電頻率，這種影響主要以興奮性為主。在MAP正常狀態(tài)下，電針大鼠不同穴位，對血壓反射有興奮或抑制性反應的神經元放電頻

13、率發(fā)生明顯變化。電針大鼠“耳穴心”(n=50)，25個神經元(50％)放電頻率增加，(凈增加率為115.2±15.25％)。電針“內關”穴(n=50)，24個神經元(48％)放電頻率增加(凈增加率為54.24±6.89％)。電針“足三里”穴(n=47)，20個神經元(42.55％)放電頻率增加(凈增加率為103.35±14.78％)。組間比較顯示，電針”耳穴心”和“足三里”兩個穴位對神經元的激活百分比增加率顯著高于“內關”穴(P<0.0

14、5)。
　　1.3.3電針刺激對PE引起血壓升高狀態(tài)MAP和NTS升壓反射相關神經元放電活動的影響
　　大鼠頸靜脈注射PE(12～16μg/kg，10～15 min)造成藥物性升壓模型，MAP由99.28±3.82 mmHg上升并維持在121.66±2.91 mmHg(P<0.001)。電針“耳穴心”和“足三里”能明顯降低實驗動物升壓平臺期的。MAP，與此同時，NTS與升壓反射相關神經元的放電明顯增加。電針“內關”雖然能輕度

15、激活NTS神經元放電，但對MAP沒有明顯影響。統計結果表明，在PE引起的升壓甲臺期，電針“耳穴心”使MAP由124.17±4.43 mmHg下降到118.7±3.64 mmHg，下降幅度8.30±0.79 mmHg(P<0.001)；電針“足三里”使MAP下降6.07±0.79 mmHg(P<0.05)；電針“內關”對MAP無明顯影響。組間比較顯示(one-way ANOVA)，電針“耳穴心”、“足三里”的降壓效應優(yōu)于“內關”(P<0.

16、05)。電針同一穴位對麻醉大鼠正常狀態(tài)和PE引起血壓升高狀態(tài)下MAP的影響無明顯差異(independent t test，P>0.05)。
　　電針不同穴位引起升壓平臺期MAP變化，同時對NTS與升壓反射相關神經元的放電頻率產生影響，這種作用主要以興奮性為主，使神經元放電增加。對升壓反射有興奮或抑制性反應的50個神經元中，完成升壓甲臺期記錄及針刺實驗的共21個。電針大鼠耳甲區(qū)穴位，9個放電頻率增加，凈增加率為92.94±10.4

17、2％。電針“內關”穴，9個放電頻率增加，凈增加率為44.66±6.27％。電針“足三里”穴，8個放電頻率增加，凈增加率為86.73±5.57％。組間比較顯示，電針“耳穴心”和“足三里”兩個穴位對神經元的激活百分比增加率顯著高于“內關”穴(P<0.05)。
　　1.3.4電針刺激對NP引起血壓降低狀態(tài)MAP和NTS降壓反射相關神經元放電活動的影響
　　大鼠頸靜脈注射NP(60～80μg/kg，10～15 min)造成藥物性降壓

18、模型，MAP由96.56±2.24mmHg下降并維持在78.29±1.84 mmHg。電針不同穴位能明顯降低實驗動物降壓平臺期的MAP，與此同時，NTS與降壓反射相關神經元的放電顯著增加。統計結果表明，在NP引起的降壓平臺期，電針“耳穴心”使MAP由79.76±1.39mmHg下降到69.32±2.48 mmHg，下降幅度10.44±1.60mmHg(P<0.001)；電針“內關”使MAP下降7.93±1.20mmHg(P<0.05)；

19、電針“足三里”使MAP下降15.63±1.76mmHg(P<0.05)；組間比較顯示(one-wayANOVA)，電針上述三個穴位的降壓效應無差異(P>0.05)。電針“耳穴心”、“足三里”，對麻醉大鼠生理情況MAP及NP降壓狀態(tài)MAP的影響無明顯差異，電針“內關”對降壓平臺期血壓的降壓效應好于生理狀態(tài)(independent，t est，P<0.05)。
　　電針不同穴位引起降壓平臺期MAP變化，同時，對NTS與降壓反射相關神經

20、元的放電頻率產生影響，這種作用主要以興奮性為主。電針“耳穴心”、“內關”和“足三里”使NTS內與降壓反射有關神經元的放電增加。對降壓反射有興奮和抑制性反應的49個神經元中，完成升壓平臺期記錄的共19個。電針大鼠耳甲區(qū)穴位，9個放電頻率增加，凈增加率為138.00±18.76％。電針“內關”穴，8個神經元放電頻率增加，凈增加率為96.75±20.51％。電針“足三里”穴，8個神經元放電頻率增加，凈增加率為100.75±31.87％。組間比

21、較顯示，電針三個穴位對神經元的激活百分比無顯著差異(組間比較，one-way ANOVA，P>0.05)。
　　2針刺對胃運動及NTS胃運動相關神經元放電活動的影響
　　2.1實驗目的:
　　觀察針刺不同穴位對正常麻醉大鼠胃內壓的影響，及靜脈注射不同交感和副交感神經受體業(yè)型激動劑引起胃運動遲緩和亢進狀態(tài)時針刺的效應，并同步觀察NTS與胃運動相關神經元在針刺調節(jié)胃運動過程中放電活動的變化，探討NTS中與胃運動相關神經元在

22、針刺調節(jié)胃腸功能中的作用。
　　2.2實驗方法:
　　實驗選用健康成年Sprague-Dawley雄性大鼠50只。實驗前禁食12-18小時，手術及實驗中動物體溫用動物恒溫系統維持在37℃左右。大鼠麻醉后進行頸靜脈、氣管插管，胃幽門部插入水囊連接壓力換能器以記錄胃內壓，并監(jiān)測血壓、心率。
　　同步記錄胃內壓及孤束核與胃運動相關神經元，找到穩(wěn)定孤束核神經元胞外放電后，記錄背景放電30s，然后分別電針、手針“耳穴心”、“內關

23、”、“中脘”、“足三里”四個穴位，同步觀察對胃運動和孤束核神經元細胞外放電的影響。對針刺有反應的神經元，分為5組，分別靜脈注射四種藥物和生理鹽水：β3體激動劑BRL37344 Salt Hydrate4-8μ g/kg；β2受體激動劑鹽酸克侖特羅0.05-0.1mg/kg；α2受體激動劑可樂定0.4-0.8mg/kg；擬膽堿藥氨基甲酰膽堿0.2-0.4mg/kg和靜脈注射0.2ml0.9％的生理鹽水。上述藥物引起胃蠕動遲緩或亢進的同時，

24、NTS神經元放電活動發(fā)生興奮或抑制的同步變化，則鑒定為孤束核與胃運動相關神經元。各組藥物注射后，繼續(xù)觀察針刺不同穴位對胃運動和孤束核與胃運動相關神經元的影響。
　　2.3實驗結果
　　2.3.1生理狀態(tài)下針刺對胃運動和NTS胃運動相關神經元放電活動的影響
　　生理狀態(tài)下，麻醉大鼠的胃運動頻率為4-5次/min，波幅在50-100mmH2O。結果表明電針刺激“耳穴心”、“內關”、“足三里”都能促進麻醉大鼠胃蠕動(P<0.

25、01)，而電針“中脘”穴則明顯減弱胃蠕動(P<0.001)。手針效果與電針效果一致(independent t test，P>0.05)。
　　針刺過程共記錄133個NTS神經元胞外放電，對針刺上述4個穴位有反應的神經元104個；靜脈注射β3受體激動劑、β2受體激動劑、α2受體激動劑、擬膽堿藥有反應的共45個，以下分組討論。在正常情況下，針刺對孤束核與胃運動相關神經元放電的影響以抑制為主。針刺不同穴位對孤束核與胃運動相關神經元的抑

26、制作用無明顯差異(one way ANOVA，LSD，P>0.05)
　　2.3.2使用β3受體激動劑后針刺對胃運動和NTS相關神經元活動的影響
　　靜脈注射β3受體激動劑后，藥物對胃運動抑制作用大約持續(xù)30-60min，胃運動蠕動波波幅下降了10-20mmH2O，胃內壓明顯降低，幅度為65.4±7.20mmH2O(P<0.001)。藥物后電針對胃運動沒有影響(P>0.05)。手針刺激“耳穴心”、“足三里”使胃內壓增高(P<

27、0.05)；手針刺激“中脘”使胃內壓降低(P<0.05)。與電針比較，手針“耳穴心”和“中脘”分別引起的胃運動的增強和抑制效應更為顯著(P<0.05)，其余穴位不同刺激無明顯差異(independen t test，P>0.05)。
　　分別針刺4個穴位對β3受體激動劑靜脈注射前后孤束核與胃運動相關神經元放電的影響無統計學差異(independen t test，P>0.05)。
　　2.3.2使用β2受體激動劑后針刺對胃運

28、動和NTS相關神經元電活動的影響
　　靜脈注射β2受體激動劑Clenbuterol(克倫布特羅)后，胃運動波幅明顯減低了10-20mmH2O，胃內壓明顯下降，幅度為51.18±9.93 mmH2O(P<0.001)。電針刺激“耳穴心”使胃內壓升高(P<0.05；電針刺激“內關”、“中脘”、“足三里”對胃運動無作用(P>0.05)。手針刺激“耳穴心”、“內關”、“足三里”能促進胃運動(P<0.01)，手針“中脘”能抑制胃運動(P<0

29、.05)。手針“內關”、“足三里”、“中脘”相比電針對胃運動的影響作用更明顯。(independent t test，P<0.05)。
　　在Clenbuterol藥物引起胃運動抑制狀態(tài)，針刺不同穴位對藥物前后孤束核與胃運動相關神經元的放電的影響無明顯差異(independen t test，P>0.05)。
　　2.3.3使用α2受體激動劑后針刺對胃運動和NTS相關神經元放電活動的影響
　　靜脈注射α2受體激動劑Cl

30、onidine后，胃運動的波幅降低了10-20mmH2O，胃內壓明顯下降，幅度為79.07±24.59 mmH2O，持續(xù)30-60min(P<0.05)。藥物后電針、手針“耳穴心”、“足三里”能促進胃運動(P<0.05)，在Clonidine藥物注射后引起胃運動遲緩狀態(tài)下，兩種刺激增強胃運動的作用無顯著差異。手針“中脘”能抑制胃運動且比電針的抑制作用更顯著(independen t test，P>0.05)。
　　針刺不同穴位對C

31、lonidine藥物靜脈注射前后孤束核與胃運動相關神經元的放電的影響無明顯差異(independent t test，P>0.05)
　　2.3.4使用擬膽堿藥后針刺對胃運動和NTS相關神經元放電活動的影響
　　靜脈注射擬膽堿藥氨基甲酰膽堿后，胃運動頻率明顯升高至6-7次/min，胃運動波幅升高了200-300mmH2O，胃內壓明顯升高，幅度為121.27±29.53 mmH2O(P<0.01)。藥物注射前后，電針和于針“耳

32、穴心”、“內關”、“足三里”均能促進胃運動(P<0.01，P<0.05，P<0.001)，電針和手針“中脘”均能抑制胃運動(P<0.01；P<0.01)。與電針相比較，在擬膽堿藥引起胃運動亢進狀態(tài)下，手針“耳穴心”和“中脘”的作用更顯著(independent t test，P<0.05)。
　　針刺不同穴位對擬膽堿藥靜脈注射前后孤束核與胃運動相關神經元的放電的影響無明顯差異(independent t test，P>0.05)。

33、靜脈注射上述四種交感和副交感受體業(yè)型激動劑對針刺調節(jié)孤束核神經元放電活動無影響。
　　3針刺對NTS與CRD相關神經元活動的影響與針刺治療內臟痛的機制
　　3.1實驗目的
　　給予麻醉大鼠梯度的CRD條件刺激，鑒別NTS中CRD“點燃”(ON cell)型和“熄火”(OFF cell)型神經元，觀察針刺作為檢驗刺激對此類神經元放電活動的影響，探討針刺在孤束核部位干預內臟痛的中樞神經系統機制。
　　3.2實驗方法<

34、br>　　正常雄性SD大鼠，監(jiān)測心率、頸總動脈血壓，記錄孤束核神經元細胞外放電。大鼠經肛門在直結腸放置長度4-5cm左右的氣囊，通過壓力計隨機給予梯度為20、40、60、80mmHg的結直腸擴張刺激(CRD)，同時用電生理單細胞記錄的方法記錄和鑒別孤束核對CRD刺激有反應的相關神經元，參照Fields等的研究大鼠RVM內存在對傷害性熱刺激引起的甩尾反射相關的“熄滅”型(OFF cell)和“點燃”型(ON cell)神經元，對梯度CRD

35、刺激產生遞增的興奮性反應的神經元，稱為“點燃”型(ON cell)，對梯度CRD刺激產生遞減的抑制性反應的神經元，稱為“熄火”型(OFF cell)。鑒別出NTS中CRD相關神經元后，待放電恢復至基礎水甲，給予CRD刺激，NTS神經元放電發(fā)生明顯“ON cell”或“OFFcell”型反應時，給予2mA、10Hz持續(xù)30s的電針不同穴位的刺激，觀察針刺“耳穴心”、“內關”、“足三里”在正常及CRD條件刺激引起NTS放電變化時對孤束核與C

36、RD“ON cell”型和“OFF cell”型神經元的影響。
　　3.3實驗結果
　　3.3.1 NTS神經元對梯度CRD刺激的反應
　　本實驗在57只大鼠共記錄到對CRD“ON cell”型神經元21個。在CRD20、40、60、80mmHg條件刺激時，NTS神經元放電由自發(fā)的205.52±30.12個/30s分別增加了21.10±5.23個/30s、56.79±11.93個/30s、86.17±13.38個/30

37、s、124.27±15.00個/30s(P<0.001，P<0.01，P<0.001，P<0.001)，為梯度增加反應。
　　另外記錄到12個CRD“OFF cell”型神經元。在CRD20、40、60、80mmHg條件刺激時，NTS神經元放電由自發(fā)的196.67±42.36個/30S分別減少了25.82±13.43個/30s、72.72±14.77個/30s、112.91±22.37個/30s、146.83±29.83個/30s

38、(P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.05)，為梯度抑制反應。
　　此外記錄到2個對梯度CRD刺激產生先興奮后抑制，3個先抑制后興奮的神經元，在本實驗中未納入統計。
　　3.3.2電針對NTS與CRD相關神經元放電活動的影響
　　CRD刺激對NTS產生“ON cell”型反應的神經元，CRD刺激前和CRD過程中電針“耳穴心”、“內關”、“足三里”都以抑制反應為主。如CRD前電針“耳穴心”放電減少了34.7

39、3±3.37個/30s(P<0.01)；CRD刺激過程電針“耳穴心”使放電減少了45.55±4.17個/30s(P<0.001)。
　　對CRD刺激產生“OFF cell”型反應的神經元，在CRD刺激前和CRD刺激過程中電針上述3個穴位都以興奮反應為主。如CRD前電針“耳穴心”使放電增加了184.26±27.35個/30s(P<0.001)；CRD刺激時電針“耳穴心”使放電增加了130.14±28.23個/30s(P<0.01)。

40、
　　4結論:
　　孤束核內存在升壓、降壓反射相關神經元，這些神經元可以分別被升壓、降壓反射興奮和抑制，表現為反應的多樣性。在生理狀態(tài)下及PE引起的升壓平臺期，這些神經元被“耳穴心”、“足三里”激活的百分比與“內關”相比更為顯著；在降壓平臺期，這些神經元被上述三個穴位激活的百分比無明顯差異，與其針刺降壓相應相一致。這說明NTS在針刺調節(jié)血壓過程中發(fā)揮重要的中樞整合作用，通過神經信號交互調節(jié)(cross talk)的方式完成對

41、血壓的調節(jié)。
　　針刺不同穴位對胃運動的影響不同，針刺“耳穴心”及與胃腸異節(jié)段的“足三里”、“內關”能顯著增強胃運動，針刺與胃腸同神經節(jié)段的“中脘”使胃運動減弱。使用交感神經不同業(yè)型神經受體激動劑后，針刺對胃運動的影響減弱；電針對胃運動的作用不如于針顯著；而針刺不同穴位對胃運動的影響也發(fā)生變化，“耳穴心”、“足三里”促進胃運動的效果比“內關”明顯。使用副交感神經的擬膽堿藥物后，不同穴位對胃運動的作用與藥物前相比無明顯變化。NTS內

42、存在與胃運動同步變化的神經元，不同植物神經受體激動劑對此類神經元的影響以興奮為主，介導了針刺“耳穴心”、“內關”、“足三里”的胃運動增強效應和“中脘”的胃運動抑制的效應，使用植物神經受體激動劑后針刺對此類神經元的效應與生理狀態(tài)下無顯著差異，以抑制NTS神經元放電為主。
　　NTS與CRD刺激相關神經元有兩類：第一類對梯度的CRD刺激產生興奮反應，表現為神經元胞外放電梯度增加，為“點燃”型神經元(ON cell)；第二類對梯度的CR