Luminex液相芯片同時(shí)檢測小鼠3種病毒方法的建立.pdf

1、仙臺(tái)病毒(Sendai virus，SeV)屬副黏病毒科，副黏病毒屬，為單股負(fù)鏈RNA病毒。SeV唯一的自然宿主是嚙齒類動(dòng)物，SeV為清潔級和SPF（Specific pathogen free，SPF）級實(shí)驗(yàn)小鼠的必須檢測項(xiàng)目。小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)是冠狀病毒科，冠狀病毒屬的正鏈RNA病毒，基因組不分節(jié)段。MHV是清潔級小鼠必檢項(xiàng)目。呼腸孤病毒3型(Reovirus type3，Reo-3)

2、屬于呼腸孤病毒科，正呼腸孤病毒屬，是雙股RNA病毒。Reo-3為SPF級實(shí)驗(yàn)小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠的必檢項(xiàng)目。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一旦上述感染病毒，將干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，影響科學(xué)研究的準(zhǔn)確性。
　　目前，實(shí)驗(yàn)室診斷主要運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等血清學(xué)方法，也可通過病毒分離方法檢測。ELISA測抗體是檢測病毒最常用的方法，但抗體在感染1-2周后才能出現(xiàn)，因此ELISA不適合感染早期的診斷。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain r

3、eaction，PCR)和RT-PCR是重要的分子生物學(xué)檢測方法，具有簡便快速的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)、細(xì)菌學(xué)、寄生蟲學(xué)檢測中。
　　Luminex液相芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代興起的新型檢測技術(shù)，它集合了激光技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)以及微球數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)。與傳統(tǒng)的臨床檢測方法相比，其主要優(yōu)點(diǎn)在于高通量、高敏感、重復(fù)性高、檢測范圍廣、反應(yīng)速度快，僅需微量樣品即可進(jìn)行檢測等。Luminex具有兩大核心技術(shù):xMAP(R)技術(shù)和xTAG

4、(R)技術(shù)。xMAP(R)技術(shù)檢測原理為抗原-抗體反應(yīng)，可用于蛋白質(zhì)和核酸的檢測;xTAG(R)技術(shù)能夠測定若干基因組形式，如基因表達(dá)分析，微RNA分析，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）分析，特定序列的檢測等。
　　目的:為建立一種能快速檢測小鼠SeV、 MHV、Reo-3等3種病毒的方法。
　　方法:聯(lián)合使用RT-PCR技術(shù)和Luminex液相基因芯片技術(shù)，針對SeV、

5、 MHV、Reo-3的保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得大小為263bp、152bp和180bp的目的片段;對引物進(jìn)行修飾，上游引物分別連接一段特定的TAG序列（與微球上的anti-TAG反向互補(bǔ)），下游引物用生物素標(biāo)記。利用修飾過的引物重新進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，產(chǎn)物與微球進(jìn)行雜交，建立小鼠3種病毒的液相基因芯片方法;并評價(jià)該方法的特異性、靈敏度。分別利用Luminex液相基因芯片和ELISA對送檢小鼠進(jìn)行檢測，對比兩種方