AIV,NDV,IBV和ILTV液相檢測(cè)芯片方法的建立.pdf

1、隨著養(yǎng)禽業(yè)集約化程度的提高，禽呼吸系統(tǒng)病毒性疾病的發(fā)病率逐漸上升，而且由單一病原感染向多種病原混合感染發(fā)展，臨床上難以鑒別診斷，往往延誤防治時(shí)機(jī)，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectious Laryngotracheitisvirus，ILTV)、傳染性支氣管炎病毒（Infe

2、ctious bronchitis virus，IBV）是引起禽類呼吸系統(tǒng)疾病的重要病毒性病原，臨床發(fā)病率高，難以鑒別診斷，因此建立一種既快速又準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，成為國(guó)內(nèi)外獸醫(yī)工作者研究的方向。液相芯片技術(shù)作為一種新型的高通量檢測(cè)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高、高通量檢測(cè)等常規(guī)方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，適合對(duì)多種病原的快速檢測(cè)。本試驗(yàn)即從單重液相芯片和多重液相芯片兩方面研究檢測(cè)AIV H5、H7、H9三種亞型，NDV、IBV、ILTV6種病毒核酸

3、的液相芯片方法，旨在為禽類呼吸系統(tǒng)病毒性疾病病原的快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。
　　 從GenBank中收集AIV的H5、H7、H9毒株的HA基因序列，NDV的F基因序列，IBV的N基因序列和ILTV的TK基因序列，分別用DNA MAN、DNA star、Primer5.0和Primer Express3.0等生物軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析，篩選出保守區(qū)，設(shè)計(jì)各個(gè)病毒的引物和探針。將設(shè)計(jì)好的探針引物進(jìn)行標(biāo)記后與熒光編碼微球偶聯(lián)。將不對(duì)

4、稱PCR/RT-PCR擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物與偶聯(lián)有微球的探針雜交，應(yīng)用Bio-Plex200系統(tǒng)分析讀取MFI值，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，并進(jìn)行了特異性、敏感性、穩(wěn)定性試驗(yàn)以及臨床樣品的檢測(cè)。
　　 通過(guò)對(duì)雜交溫度、雜交時(shí)間等反應(yīng)條件的優(yōu)化首先建立了AIV H5、H7、H9亞型，NDV、IBV、ILTV6種病毒核酸單重液相芯片的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，AIV H5、H7、H9亞型，NDV、IBV、ILTV6種病毒核酸的最低檢測(cè)濃度分別為

5、8.50×10-4ng/μL、2.87×10-4ng/μL、2.07×10-4ng/μL、2.61×10-4ng/μL、2.34×103ng/μL、2.05×10-3ng/μL,與相應(yīng)病毒RT-PCR/PCR檢測(cè)方法相比，敏感性提高10-100倍;每種芯片得到的MFI值都較高，且只能特異的檢測(cè)出各自的病毒核酸，而對(duì)其它病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性;對(duì)臨床50份已知樣品檢測(cè)的結(jié)果，相符率為100％。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所建立的檢測(cè)AIV的H5、H7

6、、H9三個(gè)亞型、NDV、IBV、ILTV6種病毒核酸的單重液相芯片技術(shù)敏感性、特異性和穩(wěn)定性均較好。
　　 在此基礎(chǔ)建立了同時(shí)檢測(cè)AIV H5、H7、H9、NDV、IBV、ILTV6種病毒核酸的多重液相芯片檢測(cè)方法。多重液相芯片的檢測(cè)方法中各個(gè)病毒探針對(duì)相應(yīng)病毒核酸檢測(cè)的MFI值較高，與其他病毒之間沒(méi)有交叉反應(yīng)，重復(fù)性好;每種病原核酸的最低檢測(cè)濃度分別為5.44×10-4ng/μL、1.84×10-3ng/μL、2.65×10-

7、4ng/μL、8.35×10-3ng/μLng/ul、1.50×10-3ng/μL、6.56×10-3ng/μL，靈敏度比相應(yīng)PCR/RT-PCR方法提高了5-125倍。應(yīng)用建立的液相芯片體系對(duì)50份已知病毒樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果符合率為100％。
　　 本試驗(yàn)成功地建立了檢測(cè)AIV H5、H7、H9、NDV、IBV和ILTV6種病毒核酸的單重液相芯片和多重液相芯片的方法，為禽呼吸系統(tǒng)病毒性疾病的快速、高通量鑒別診斷搭建了新的技術(shù)平