△Np73基因?qū)Υ竽c癌侵襲性的影響及其反義基因?qū)Υ竽c癌的治療作用研究.pdf

1、研究背景：大腸癌是一種對(duì)人類健康和生命威脅很大的惡性腫瘤，其發(fā)生與多種因素有關(guān)。大量遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究表明，p73基因的異常表達(dá)與大腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)都有著密切的關(guān)系?！鱊p73基因是p73基因的一個(gè)亞型，缺乏NH2術(shù)端反式轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，是“縮短”了的p73基因。近年來(lái)的研究表明，ANp73基因作為p73基因的異構(gòu)體，的確參與了腫瘤的發(fā)生機(jī)制，但ANp73基因在大腸癌中與抑癌基因之間的相互作用關(guān)系尚未明了，主要是：(1)ANp7

2、3基因在多種人類腫瘤中均很少有突變發(fā)生，但在大腸癌中卻發(fā)生了突變；(2)ANp73基因在大腸癌中與周圍正常組織比較表達(dá)明顯增強(qiáng)；(3)ΔNp73基因敲除鼠并不發(fā)生自發(fā)性的腫瘤。因此，ΔNp73基因作為抑癌基因p53基因家族成員p73基因的異構(gòu)體究竟是癌基因還是抑癌基因?至今尚未明了。雖然研究已表明，ΔNp73基因在大腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，但ΔNp73基因的表達(dá)在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中的起著什么樣的生物學(xué)作用機(jī)制?迄今有關(guān)文獻(xiàn)鮮見(jiàn)報(bào)道。有鑒于

3、此，這也正是本研究想要進(jìn)一步闡明的課題。 目的：研究ΔNp73基因的生物學(xué)特性；進(jìn)一步闡明ΔNp73在人類大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制；并探討反義ΔNp73基因作為臨床大腸癌基因治療的新靶點(diǎn)的潛在價(jià)值。 方法：將ΔNp73基因構(gòu)建于真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3，通過(guò)脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染的方法將外源性ΔNp73基因轉(zhuǎn)染人類大腸癌細(xì)胞株LOVO，用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)ΔNp73基因的細(xì)胞克隆，RT-PCR和westernblot對(duì)所篩

4、選的細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定。將篩選得到的穩(wěn)定表達(dá)ΔNp73基因細(xì)胞株放大培養(yǎng)，觀察ΔNp73基因?qū)OVO細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響。以轉(zhuǎn)染ΔNp73基因后大腸癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)情況、凋亡率、侵襲性、腫瘤血管生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子的變化作為切入點(diǎn)，利用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Boyden小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)、腫瘤MVD測(cè)定以及逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、westernblot等多種實(shí)驗(yàn)室技術(shù)檢測(cè)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)及侵襲性的變化，并利用反義技術(shù)構(gòu)建反義ΔNp73真核

5、表達(dá)載體，探討反義ΔNp73基因?qū)Υ竽c癌的治療作用，并反證ΔNp73基因?qū)Υ竽c癌的侵襲性的影響。應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：將ΔNp73基因以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞后，經(jīng)G418成功的篩選出穩(wěn)定表達(dá)ΔNp73基因的細(xì)胞株。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了ΔNp73基因后的LOVO細(xì)胞生長(zhǎng)速度較未轉(zhuǎn)染ΔNp73的LOVO細(xì)胞明顯加快(P＜0.01)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示表達(dá)ΔNp73的細(xì)胞株凋亡率降低，Boyd

6、en小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，LOVO-ΔNp73細(xì)胞穿膜數(shù)較空白對(duì)照組和LOVO-pcDNA3組增多，差異具有顯著性(p＜0.01)。與空白對(duì)照組相比，LOVO-ΔNp73細(xì)胞中VEGF表達(dá)較未轉(zhuǎn)染ΔNp73基因的細(xì)胞明顯增高(p＜0.01)。RT-PCR半定量法檢測(cè)LOVO細(xì)胞中的VEGFmRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ΔNp73基因顯著增加了VEGFmRNA的表達(dá)(p＜0.01)；westernblot半定量法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ΔNp73基

7、因同樣增強(qiáng)了LOVO細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)水平(p＜0.01)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，ΔNp73基因同樣促進(jìn)了裸鼠種植瘤的生長(zhǎng)，并增加了腫瘤的MVD(p＜0.05)。利用反義技術(shù)構(gòu)建反義并轉(zhuǎn)染LOVO細(xì)胞后，檢測(cè)以上指標(biāo)，結(jié)果提示腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制，侵襲性降低，血管生成減少，說(shuō)明反義ΔNp73基因?qū)Υ竽c癌具有治療作用，同時(shí)也反證了ΔNp73基因在大腸癌發(fā)病中所起的作用更類似一個(gè)癌基因。 結(jié)論：ΔNp73基因在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演了癌