端粒酶與大腸癌相關性及RNAi沉默hTERT基因治療大腸癌的研究.pdf

1、在我國，消化道惡性腫瘤中大腸癌發(fā)病占有很高的比率。目前以手術治療為主的綜合治療仍存在局限性，療效不盡人意。因此，能否找到一個有效的分子治療靶點，是豐富大腸癌治療方法和最終應用于臨床提高綜合療效的關鍵。有研究表明，大腸癌標本中端粒酶活性表達高達85％以上，而正常組織表達僅5％左右。端粒酶全酶由端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相關蛋白(TPI)和端粒酶催化亞基(hTERT)三部分組成。hTR和TPI在正常組織和腫瘤組織均有表達，與端粒酶活性無

2、相關性。而hTERT與端粒酶的活性相一致，hTERT基因是合成端粒酶全酶的限速因素，與腫瘤的關系尤為密切，因此將端粒酶作為腫瘤分子靶點的研究是極有意義的研究領域。本研究從本院臨床收集30例大腸癌組織、癌旁組織及正常大腸組織，通過對端粒酶活性的檢測，探討端粒酶與大腸癌的相關性，并進一步驗證端粒酶催化亞基(hTERT)的表達是否與端粒酶活性一致。同時回顧性分析本院178例大腸癌患者病理標本中hTERT表達水平和臨床病理學參數之間的相關性;通

3、過臨床隨訪資料分析，闡明影響大腸癌患者生存預后的風險因素，明確hTERT能否作為判斷大腸癌預后的標志物及作為大腸癌治療的分子靶點。通過RNAi沉默技術，觀察hTERT沉默對大腸癌細胞生長增殖和凋亡的影響，最終闡明hTERT基因RNAi沉默技術對大腸癌靶向治療的可行性。本研究將從細胞、分子和整體水平上，為開展大腸癌hTERT基因靶向治療提供實驗和臨床依據。
　　第一部分端粒酶與大腸癌相關性研究
　　第一章端粒酶活性與大腸癌相關

4、性研究
　　目的：探討端粒酶與大腸癌相關性，進一步驗證端粒酶催化亞基(hTERT)的表達是否與端粒酶活性一致。方法：運用PCR-TRAP-ELISA及免疫組織化學方法對大腸癌組織及其癌旁組織、大腸正常組織各30例檢測端粒酶活性、hTERT的表達水平，并研究端粒酶與臨床病理學特征之間的關系。結果(1)端粒酶陽性檢出率在大腸癌組織、癌旁組織、大腸正常組織分別為83.33％13.33％3.33％，癌組織中檢出率明顯高于其他組織（P＜0.

5、05）。(2)大腸癌組織端粒酶活性隨組織分化程度變低而升高，低分化大腸癌組織中的端粒酶陽性表達率高于中分化及高分化大腸癌(P＜0.05)。(3)通過用免疫組化檢測hTERT的表達與PCR-TRAP-ELISA法檢測得端粒酶活性相比較，顯示端粒酶活性與hTERT表達具有一致性，兩法檢測無顯著差異。結論(1)大腸癌組織端粒酶陽性率明顯高于癌旁組織及正常大腸組織，大腸癌組織中hTERT表達高于癌旁組織及正常組織。(2) hTERT的表達與端粒

6、酶活性一致。
　　第二章端粒酶催化亞基與大腸癌預后因素分析
　　目的：通過對178例大腸癌患者的臨床資料回顧性分析，闡明hTERT表達水平與大腸癌臨床病理特征及預后的關系，為大腸癌患者的預后評估提供一定的理論指導。方法：選取有完整臨床資料的178例大腸癌石蠟包埋組織標本及60例癌旁組織標本作為實驗組，30例大腸正常組織石蠟包埋標本作為對照組。采用免疫組化的方法檢測大腸癌組織中hTERT蛋白表達水平。查閱病例獲得相關臨床參數資

7、料及隨訪資料，分析hTERT表達水平與大腸癌進展及臨床預后的關系。結果：(1) hTERT蛋白在大腸癌組、癌旁組與大腸正常組中陽性率分別為94.4％、6.67％、3.33％，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);(2) hTERT在大腸癌組織中的表達與性別、年齡、淋巴結轉移、腫瘤直徑無關(P＞0.05)，與腫瘤分化程度、浸潤深度、Dukes分期、臨床分期及遠處轉移有關(P＜0.05)。(3)經多因素Cox模型分析，不同浸潤深度、遠處轉移

8、、淋巴結轉移、hTERT表達4項指標是影響大腸癌患者術后預后的獨立危險因子;hTERT表達水平與患者術后無瘤生存時間呈負相關。結論：hTERT在大腸癌組織中呈高表達。經多因素Cox分析，大腸癌浸潤深度、遠處轉移、淋巴轉移、hTERT表達與大腸癌患者預后存在顯著性相關，是影響預后的危險因子。大腸癌組織中hTERT高表達者預后相對較差，低表達者預后相對較好。
　　第二部分 RNAi沉默hTERT基因治療大腸癌的實驗研究
　　第一

9、章 hTERT基因shRNA真核表達載體的構建
　　目的：構建人端粒酶催化亞基(hTERT)基因shRNA真核表達載體質粒，為大腸癌RNAi介導的基因治療打下基礎。方法：化學合成3條hTERT基因siRNA，通過脂質體轉染大腸癌細胞SW480，48h后采用RT-PCR方法篩選出一條對hTERTmRNA有明顯沉默作用的siRNA。將篩選出的siRNA設計并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成雙鏈后，插入到pGPU6/GFP/Neo真

10、核表達載體中，并進行酶切和測序鑒定。結果：酶切和DNA測序證實構建的ShRNA已插入載體中。結論：成功構建的hTERT基因shRNA真核表達載體pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA，為進一步開展hTERT基因在人大腸癌細胞中的作用機制及體內外RNAi實驗研究奠定了基礎。
　　第二章 RNAi沉默hTERT基因對大腸癌SW480細胞生物學特性的影響
　　目的：觀察hTERT基因對SW480細胞生物學特性的影響。方

11、法：將重組質粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA（hTERT-shRNA）用脂質體轉染法導入SW480大腸癌細胞，含無效序列的pGPU6/GFP/Neo-NC shRNA(NC-shRNA)作為陰性對照，單純SW480細胞作為空白對照，等量轉染試劑脂質體作為脂質體對照組，分別于轉染后24h、48h、72h，在熒光顯微鏡下觀察重組質粒轉染效率和細胞形態(tài)學變化。采用MTT法檢測各組細胞的生長增殖情況，RT-PCR法檢測不同轉

12、染時間細胞hTERT mRNA的表達水平，免疫細胞化學法檢測hTERT特異性蛋白表達;PCR-TRAP-ELISA法檢測轉染后48小時端粒酶活性;流式細胞儀檢測轉染后細胞周期分布，TUNEL法和透射電鏡觀察轉染后細胞凋亡變化及線粒體膜電位(MMP)的改變檢測。結果：(1) hTERT-shRNA質粒轉染24h、48h及72h比較，轉染48h其轉染效率明顯高于24h和72h的轉染效率，質粒與脂質體比例為1∶2.5時，其轉染效率顯著高于其它

13、各組，轉染率達59％。(2) MTT檢測結果顯示:hTERT-shRNA質粒轉染組對SW480細胞的生長增殖有明顯抑制作用，于轉染后第2d達到峰值，增殖率減少達28.22％，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(3)半定量RT-PCR結果顯示，轉染48小時的hTERT-shRNA組的hTERT mRNA表達量明顯低于轉染24h和72h組的表達量。轉染48小時的hTERT-shRNA組和空白對照組、脂質體對照組、NC-shRNA

14、組比較，其抑制率分別是39.20％，33.28％，27.95％。(4)免疫細胞化學結果示:hTERT-shRNA組染色陽性細胞明顯少于對照組。經病理圖像分析軟件進行灰度測量后比較發(fā)現，轉染48h的hTERT-shRNA組較空白對照組灰度值下降約30.2％，同時和脂質體對照組和NC-shRNA組相比，差異均有明顯統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。(5)PCR-TRAP-ELISA端粒酶活性檢測顯示:較空白對照組相比，hTERT-shRNA轉染組

15、細胞端粒酶活性下降了18.7％，與較其它三組之間差別均有顯著性意義(P＜0.05)。(6)流式細胞術檢測:與對照組比較，hTERT-shRNA組G0/G1期細胞顯著增加。與NC-shRNA組比較，hTERT-shRNA組增殖指數(PI)下降14.2％，差別有顯著學意義（P＜0.05）。(7) TUNEL法檢測:hTERT-shRNA組凋亡細胞數顯著多于對照組，因而其凋亡指數較其它組也明顯增高，hTERT-shRNA組較空白對照組AI增高

16、20％。(8)轉染48h后透射電鏡觀察:可見凋亡細胞體積明顯縮小，表面突起和微絨毛減少，甚至消失，染色質不均勻地地沿核膜下聚集。部分可見細胞核新月體，空泡形成增多。(9)與空白對照組相比，轉染48h后線粒體跨膜電位(MMP)顯示:hTERT-shRNA組線粒體Rhodamine123熒光強度明顯增強（增加約24.2％），MMP顯著下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論：RNAi沉默hTERT基因能有效抑抑制SW480

17、腫瘤細胞生長和增殖，并降低端粒酶活性，誘導腫瘤細胞凋亡。
　　第三章 RNAi沉默hTERT基因治療大腸癌移植瘤的動物實驗研究
　　目的：探討重組pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA質粒對SW480細胞裸鼠移植瘤的生長抑制作用。方法：(1)經皮下接種SW480細胞株(1×107個細胞/只)建立裸鼠人大腸癌細胞移植瘤模型。(2)24只裸鼠隨機地分為3組，每組8只。以瘤內接種pGPU6/GFP/Neo-hTERT

18、shRNA（簡稱hTERT-shRNA）質粒組為實驗組，以瘤內注射pGPU6/GFP/Neo-NCshRNANC（簡稱NC-shRNA）作為陰性對照，以瘤內注射生理鹽水作為空白對照組。(3)觀察各組裸鼠皮下腫瘤生長情況，繪制腫瘤生長曲線，計算腫瘤抑制率。(4)治療結束后取標本進行病理學檢查、hTERT mRNA及hTERT蛋白表達分析，端粒酶活性及組織凋亡檢測。結果：(1)所有裸鼠均于7天后可見皮下腫瘤形成。(2) hTERT-shRN

19、A組裸鼠腫瘤生長較慢，生理鹽水對照組和NC-shRNA陰性對照組裸鼠腫瘤仍較快增大。(3)hTERT-shRNA組腫瘤組織切片HE染色，部分腫瘤可見大片壞死區(qū)，細胞結構消失。生理鹽水組和NC-shRNA組腫瘤生長良好，細胞形態(tài)不規(guī)則，可見病理性核分裂相。(4)半定量RT-PCR檢測hTERTmRNA水平，發(fā)現hTERT-shRNA組較生理鹽水對照組和NC-shRNA陰性對照組分別下降52.1％和48.3％，差異具有顯著性意義(P＜0.0

20、1)。(5)免疫組化結果表明:hTERT-shRNA組腫瘤組織中hTERT陽性細胞明顯減少，蛋白表達下調。hTERT蛋白平均灰度較生理鹽水組和NC-shRNA組分別降低19.9％和14％。(6)端粒酶活性檢測表明，pGPU6/GFP/Neo-hTERT組較生理鹽水組和NC-shRNA組端粒酶活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。端粒酶活性抑制率分別為48.5％和53.0％。(7) TUNEL法檢測發(fā)現，hTERT