檢測(cè)豬肺表面活性蛋白A-D基因?qū)崟r(shí)熒光定量和納米PCR方法的建立.pdf

1、表面活性蛋白A（surfactant proteins，SP-A）和表面活性蛋白D(surfactant proteins，SP-D)對(duì)肺部的發(fā)育、成熟起到重要作用。SP-A和SP-D基因的表達(dá)量與呼吸系統(tǒng)免疫防御息息相關(guān)，對(duì)肺部的異常病變具有指示作用，所以可以作為多種肺部疾病的生物標(biāo)記。為檢測(cè)體內(nèi)SP-A/SP-D基因，本研究建立了兩種檢測(cè)方法:即熒光定量PCR方法和納米金PCR方法，并且驗(yàn)證這兩種方法的特異性及靈敏性。
　　

2、 根據(jù)豬SP-A基因序列（NM_214265.1）和豬SP-D基因序列(NM_214110)設(shè)計(jì)特異性引物，將SP-A的CDS區(qū)(750bp)和SP-D的CDS區(qū)(1137bp)分別鏈接至PMD-18T載體，構(gòu)建了豬SP-A基因和SP-D基因CDS區(qū)全序列重組質(zhì)粒PMD-SP-A和PMD-SP-D。設(shè)計(jì)并合成了特異性的引物和探針，以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)探針、引物等濃度及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，建立了豬SP-A/SP-D基因的TaqMan熒光定

3、量PCR方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:所建立熒光定量PCR檢測(cè)方法為異性擴(kuò)增;SP-A基因檢測(cè)下限達(dá)到2.50×101 copies/μl，而SP-D基因更是達(dá)到100copies/μl（約3copies）;批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于2.5％;擴(kuò)增效率在98％-108％之間。本實(shí)驗(yàn)建立的豬SP-A/SP-D基因TaqMan熒光定量PCR方法敏感性高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)，可以用于豬SP-A/SP-D基因的定量檢測(cè)。
　　 沿用熒光定量PCR方

4、法的特異性引物，以SP-A/SP-D重組質(zhì)粒為模板，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了納米金PCR（Nano PCR）方法，并對(duì)其靈敏度進(jìn)行了測(cè)定。由于一些研究推測(cè)，納米金能夠替代PCR反應(yīng)體系中的鎂離子，為了檢驗(yàn)這一推論，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)兩組PCR反應(yīng)體系，一組無(wú)鎂離子，一組添加鎂離子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Nano PCR法亦能擴(kuò)增得到與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的特異性條帶，靈敏度與熒光PCR方法相當(dāng)，SP-A基因檢測(cè)下限達(dá)2.53×101copies/μl，SP-D基因達(dá)

5、到100copies/μl（約3copies）。在實(shí)驗(yàn)組中，無(wú)鎂離子的實(shí)驗(yàn)組能靈敏地?cái)U(kuò)增出特異性條帶，但添加鎂離子的對(duì)照組檢測(cè)靈敏度要更好，說(shuō)明納米金粒子可以起到反應(yīng)體系中的鎂離子的作用，而鎂離子與納米金粒子兩種粒子對(duì)PCR反應(yīng)效果的增強(qiáng)作是相對(duì)獨(dú)立的，不是簡(jiǎn)單的替代關(guān)系。
　　 為了對(duì)比，本研究使用ExTaq酶，以重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化，構(gòu)建了SP-A/SP-D基岡的普通PCR檢測(cè)方法。用普通PCR方法檢測(cè)

6、SP-A/SP-D基因的靈敏度下限僅為104copies/μl，其靈敏度遠(yuǎn)小于熒光定量PCR方法和Nano PCR方法。對(duì)比實(shí)驗(yàn)證明，本研究所建立的兩種檢測(cè)方法比普通PCR檢測(cè)效率要高。
　　 本研究創(chuàng)造性地為檢測(cè)微量SP-A/SP-D基因提供了一套高效雙保險(xiǎn)檢測(cè)方法。從理論上講，探針?lè)晒舛縋CR能準(zhǔn)確定帶檢測(cè)目的基因，將這一方法應(yīng)用到豬SP-A/SP-D基因的研究中，能夠達(dá)到檢測(cè)目的基因含量的要求，為這兩種基因的后續(xù)研究奠

7、定了基礎(chǔ)。而NanoPCR是一種新興的PCR方法，目前對(duì)于Nano PCR的研究仍然甚少，本實(shí)驗(yàn)為Nano PCR的廣泛應(yīng)用做了進(jìn)一步探索，雖然Nano PCR方法不能準(zhǔn)確檢測(cè)出目的基因的含量，但其有著靈敏性高、特異性好的特點(diǎn)，而且成本較熒光PCR方法要小很多。從實(shí)際意義上講，近些年對(duì)豬SP-A/SP-D基因的研究正在逐步深入，已經(jīng)證實(shí)這兩種基因?qū)Χ喾N肺部疾病都有指示作用，但仍沒(méi)有高靈敏度定量PCR檢測(cè)方法出現(xiàn)，本研究所建立的兩種檢測(cè)S