DNA聚合酶β、GST-π基因表達的調控對食管癌細胞耐藥性的作用.pdf

1、食管癌是中國(尤其河南省林州市及輝縣)最常見的惡性腫瘤之一，該地區(qū)食管癌的發(fā)病率、死亡率均極高。化療是食管癌主要的臨床治療手段之一，然而腫瘤細胞多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)現象的產生常影響化療藥物的療效，MDR是導致腫瘤化療失敗的主要原因，資料表明，90％以上腫瘤患者的死因與MDR有關。MDR指的是腫瘤細胞在接觸某一種化療藥物后，不僅對此種藥物產生耐受性，而且對其它的結構和功能不同的多種藥物也產生交叉耐受

2、性。MDR是惡性腫瘤難治和復發(fā)的重要原因之一，是腫瘤細胞在生存壓力之下建立起來的一種適應過程。腫瘤細胞可以通過多種機制產生MDR，如細胞膜上表達的藥物排流泵通過泵機制把藥物從細胞內排出細胞外、細胞解毒能力的增強(如谷胱甘肽轉移酶GST-π)、DNA修復能力的增強(如DNA聚合酶β)、藥物靶蛋白(如拓撲異構酶TopoⅡ)量或活性的改變、蛋白激酶C各種同工酶活性和表達水平的改變等。不同腫瘤細胞可通過不同的途徑導致MDR的發(fā)生，一種腫瘤細胞可

3、同時存在多種耐藥機制。 因此體外建立食管癌耐藥細胞系，篩查食管癌耐藥相關基因，從基因表達水平尋找在耐藥產生中具有關鍵作用的分子改變，對于全面了解腫瘤細胞的耐藥機制，尋找逆轉藥物耐受的分子靶點具有重要的理論和現實意義。 本研究首先用食管癌細胞EC9706作為親本細胞誘導建立耐藥細胞系EC9706/cDDP。在此基礎上，用RT-PCR方法篩選食管癌耐藥相關基因，之后選取polβ、GST-π基因進一步研究其與食管癌耐藥的相關性

4、。通過調控其表達水平觀察對食管癌細胞耐藥性的作用，即分別構建這2個基因的真核表達載體，轉染入EC9706細胞，初步觀察其生物學效應，尤其對耐藥指數的影響; 并構建靶向這2個基因的siRNA重組慢病毒，探討其體外對食管癌細胞耐藥性逆轉的效果以及在裸鼠體內逆轉移植瘤耐藥性的效果。 論文分4部分： 第一部分人食管鱗癌順鉑耐藥細胞系EC9706/cDDP的建立及相關耐藥基因的篩選 方法：采用順鉑(cDDP)中等濃度、間歇

5、作用方法歷時9個月建立耐藥細胞系EC9706/cDDP，光學顯微鏡觀察耐藥細胞的形態(tài)學特點；MTT法測定其對cDDP、5-FU、長春新堿、紫杉醇的敏感性，觀察凍存、撤藥對耐藥性的影響；比較耐藥與親本細胞生長曲線、群體倍增時間、貼壁率的不同；流式細胞儀測細胞周期；軟瓊脂實驗測細胞的惡性增殖能力；羅丹明攝入/排出實驗測定P-gp功能；RT-PCR半定量方法測定親本細胞及耐藥細胞耐藥相關基因如DNA聚合酶(polβ)、多藥耐藥相關基因(MRP

6、)、谷胱甘肽轉移酶-π(GST-π)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、拓撲異構酶(Topo Ⅱ)和多藥耐藥基因(mdrl)等基因的tuRNA表達水平。 結果：人食管鱗癌順鉑耐藥細胞系EC9706/cDDP在形態(tài)學上與親本細胞無明顯差別，但對cDDP的敏感性降低，耐藥指數為15.7，同時對未接觸過的5-FU、長春新堿、紫杉醇等有交叉耐藥性，耐藥指數分別為：3.2、2.8、1.8。凍存對耐藥性影響不大，撤藥培養(yǎng)可使細胞耐藥性降低，耐藥細

7、胞群體倍增時間延長(29.79±0.48h vs 25.79±0.45h)，生長緩慢，G0/G1、S期細胞比例增加，克隆形成率明顯高于親本細胞，二種細胞對羅丹明攝入/排出的差異無統計學意義。polβ、DHFR、GST-π基因tuRNA的表達比親本細胞顯著增加(P<0.05)，TopoⅡ的表達降低(P<0.05)，而mdrl、MRP表達的增加無顯著統計學意義(P>0.05)。 第二部分 polp、CST-π真核表達載體的構建及轉染

8、EC9706細胞的生物學效應研究 方法： 1．設計帶有接頭的GST-π全cDNA引物，提取EC9706細胞mRNA，RT-PCR擴增出GST-π全基因，插入T載體，進行序列分析，亞克隆入真核表達載體piRES2-AcGFP1中。 2．設計帶有接頭的polβ全cDNA引物，從野生型polβ的重組質粒pcDNA3.1-polβ中擴增出polβ的放閱讀框序列，插入T載體，亞克隆入真核表達載體pIRES2-AcGFP1中

9、。 3．將構建好的2種重組載體脂質體轉染法分別導入EC9706細胞，G418篩選獲得分別穩(wěn)定高表達GST-π、polβ的EC9706細胞。細胞形態(tài)學觀察、生長曲線測定，用半定量RT-PCR和Western-blot測定轉染細胞GST-π、polβ的表達，MTT法測細胞對順鉑敏感性的變化，雙層軟瓊脂試驗檢測細胞惡性程度。 結果： 1．分別構建了GST-π真核表達載體(pIRES2-AeGFP1-GST-π)和pol

10、β真核表達載體(pIRES2-AcGFP1-pol β)。分別轉染EC9706細胞后在熒光顯微鏡下可發(fā)出綠色熒光，經篩選得到分別高表達GST-π、野生型polβ的EC9706細胞，轉染前后細胞形態(tài)沒有明顯改變。 2．轉染pIRES2-AcGFP1-GST-π的細胞中GST-π mRNA的相對表達水平(2.34±0.12)比未轉染細胞(0.94±0.14)明顯增加(P<0.05)。GST-π蛋白的相對表達水平比未轉染細胞明顯增加。

11、對eDDP的耐藥指數為2.36。 3．轉染pIRES2-AeGFPI-polβ的細胞中polβmNA的相對表達水平(1.21±0.15)比未轉染細胞(0.52±0.13)明顯增加(P<0.05)。polβ蛋白的相對表達水平比未轉染細胞明顯增加。對eDDP的耐藥指數為1.78。雙層軟瓊脂試驗結果，EC9706-polβ細胞的集落生成率為57％，與EC9706(24％)及空質粒對照EC9706-KC(26％)的集落生成率相比差異有統

12、計學意義(P<0.05)。 第三部分靶向GST-π、polβ的siRNA慢病毒的構建及其對EC9706/cDDP細胞耐藥性的逆轉 方法：設計分別靶向GST-π、polβ的編碼短發(fā)夾RNA的DNA單鏈模板各2對，退火后定向克隆入慢病毒載體pRNAT-U6.2/Lenti，PCR篩選陽性克隆，測序鑒定得到靶向GST-π、polβ的siRNA慢病毒表達載體： GSTsil、GSTsi2、polsil、polsi2。用293FT

13、細胞包裝病毒，收集病毒液，以細胞GFP蛋白的表達水平測定病毒滴度。分別感染EC9706/eDDP細胞，RT-PCR、Western blot測感染細胞中GST-π、polβ的表達；MTT法測細胞對順鉑敏感性的變化；免疫熒光實驗觀察重組慢病毒的干擾效果。 第四部分裸鼠荷瘤試驗 方法： 1．用EC9706和EC9706/cDDP細胞通過皮下注射的方法建立2種裸鼠移植瘤模型，觀察成瘤時間。當移植瘤的直徑約5mm時，開始

14、治療試驗。 2．荷瘤裸鼠EC9706 4只，瘤體內多點注射cDDP(200μg/ml，0.1ml，每3天1次，連續(xù)4次)。 3.16只荷瘤裸鼠EC9706/cDDP，隨機分成4組：PBS組、cDDP(200μg/ml)組、cDDP+GSTsi2慢病毒組(200μg/ml cDDP與靶向GST-π的慢病毒液等量混勻)、cDDP+polsi1慢病毒組(200μg/ml cDDP與靶向polβ的慢病毒液等量混勻)。分別在瘤體內

15、多點注射各0.1ml，每3天1次，連續(xù)4次，定期觀察腫瘤大小。 4．治療結束后處死各組裸鼠，取出移植瘤組織，測量體積。 結論： 1．建立了人食管鱗癌順鉑耐藥細胞系EC9706/cDDP，且耐藥性穩(wěn)定，為耐藥機制及耐藥逆轉研究提供實驗模型。其耐藥性的產生與polβ、GST-π、DHFR、TopoⅡ等基因的異常表達有較高相關性，而與mdr1、MRP表達的相關性不明顯； 2．GST-π表達的增加可導致食管癌細胞

16、對化療藥順鉑敏感性的降低；用RNAi技術沉默GST-π的表達可一定程度逆轉食管癌細胞的順鉑耐藥性； 3．polβ的表達增加可導致食管癌細胞對化療藥順鉑敏感性的降低及細胞惡性表型的增加；用RNAi技術沉默polβ的表達可一定程度逆轉食管癌細胞的順鉑耐藥性； 4．分別用EC9706和EC9706/cDDP構建了荷瘤裸鼠，EC9706/cDDP具有較高的體內順鉑耐藥性； 5．運用靶向GST-π的高滴度重組慢病毒合并cD