食管癌細(xì)胞株中T-cadherin基因表達(dá)及其甲基化調(diào)控研究.pdf

1、目的:食管癌的發(fā)病率占全球所有惡性腫瘤的第九位，我國(guó)也是食管癌高發(fā)國(guó)家，其中鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)約占病例總數(shù)的90％以上，研究已表明食管癌的發(fā)生發(fā)展與多種癌基因過(guò)度表達(dá)，以及腫瘤抑制基因失活密切相關(guān)。但目前對(duì)其發(fā)生發(fā)展的精確分子機(jī)制尚不完全清楚。表觀遺傳學(xué)是研究基因表達(dá)的學(xué)科，是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要分子事件。基因異常甲基化是除突變、缺失和移位之外的另一種基因異常改變，對(duì)它的研究將有助于尋找新的診斷治療靶點(diǎn)，對(duì)食管癌的早期診斷、

2、治療、預(yù)后評(píng)價(jià)以及預(yù)防具有重大意義。T-cadherin分子(又稱(chēng)CDH13或H-cadherin)屬于細(xì)胞粘附分子cadherin超家族。T-cadherin基因在乳腺癌、肺癌、肝癌、及結(jié)直腸癌中并未發(fā)生缺失突變，但由于其啟動(dòng)子異常甲基化導(dǎo)致T-cadherin基因失活，進(jìn)而導(dǎo)致其蛋白表達(dá)水平顯著下降或缺失。提示T-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化是T-cadherin基因在腫瘤中失活的重要機(jī)制。目前對(duì)食管癌細(xì)胞株中T-cadheri

3、n基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，以及應(yīng)用去甲基化藥物是否能誘導(dǎo)T-cadherin分子在食管癌細(xì)胞株中重新表達(dá)，并抑制食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性特征目前尚缺乏研究報(bào)道。本研究探討T-cadherin基因在食管癌細(xì)胞中失活的分子機(jī)制，以及去甲基化藥物5-雜氮-2'-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲以及T-cadherin基因甲基化狀態(tài)與表達(dá)的影響，以揭示T-cadherin基因甲基化在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為食管

4、癌的早期診斷、治療及預(yù)防提供依據(jù)。
　　 方法:1.本研究通過(guò)甲基化特異性PCR(MSPCR)法檢測(cè)了食管癌細(xì)胞株EC1中T鈣粘蛋白(T-cadherin)基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，利用去甲基化試劑5-Aza-CdR處理食管癌細(xì)胞株EC1后，再用MSPCR法檢測(cè)甲基化逆轉(zhuǎn)情況。
　　 2.采用Western Blot免疫印跡法檢測(cè)食管癌細(xì)胞株EC1經(jīng)過(guò)5-Aza-CdR處理前后T-cadherin基因的表達(dá)變化情況，以便

5、選擇T-cadherin基因?yàn)檫M(jìn)一步研究的靶點(diǎn)。
　　 3.MTT比色法檢測(cè)經(jīng)去甲基化藥物5-Aza-CdR不同濃度處理后的食管癌細(xì)胞隨藥物濃度變化的生長(zhǎng)情況。
　　 4.體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)食管癌細(xì)胞的侵襲能力，用穿膜細(xì)胞數(shù)的多少來(lái)表示細(xì)胞侵襲能力的大小。
　　 結(jié)果:1.甲基化特異性PCR法檢測(cè)顯示，T-cadherin基因在食管癌細(xì)胞株EC1中出現(xiàn)甲基化和非甲基化條帶，表明發(fā)生了半甲基化。提示T-cadheri

6、n基因啟動(dòng)子區(qū)處于異常甲基化狀態(tài)。
　　 2.使用5μmol/l去甲基化藥物5-Aza-CdR處理EC1細(xì)胞后，甲基化特異性PCR法檢測(cè)顯示T-cadherin基因在細(xì)胞中只出現(xiàn)非甲基化條帶，說(shuō)明其甲基化的情況得到了逆轉(zhuǎn)。
　　 3.Western blot檢測(cè)顯示經(jīng)不同濃度去甲基化藥物5-Aza-CdR處理后的EC1細(xì)胞中T-cadherin蛋白的表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。
　　 4.不同濃

7、度5-Aza-CdR處理后，EC1細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，且隨著藥物濃度的增加抑制程度逐漸增加，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 5.不同濃度5-Aza-CdR處理后，食管癌細(xì)胞中穿膜細(xì)胞數(shù)減少，隨著5-Aza-CdR濃度的增加穿膜細(xì)胞數(shù)明顯下降，與對(duì)照組比較，（P＜0.01）。
　　 結(jié)論:1.T-cadherin在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)下降與啟動(dòng)子甲基化密切相關(guān)。
　　 2.應(yīng)用去甲基化藥物能夠