原癌基因BCL11A在非小細胞肺癌中的異常表達及其調(diào)控機制.pdf

1、研究背景：
　　 肺癌居我國惡性腫瘤死因首位,可分為非小細胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)兩大類,其中非小細胞肺癌約占80％以上。盡管肺癌的早期診斷和規(guī)范化治療都取得了一定的進步,但只有15-25％的非小細胞肺癌有手術(shù)治療的機會,而即使接受根治性手術(shù)治療,仍然有50％的NSCLC患者會復(fù)發(fā)。傳統(tǒng)的多學(xué)科綜合治療(手術(shù),放

2、療和化療)在提高非小細胞肺癌的五年生存率方面已經(jīng)出現(xiàn)了“天花板效應(yīng)”[1]。隨著近幾年轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的出現(xiàn),將肺癌基礎(chǔ)研究的結(jié)果向臨床診療轉(zhuǎn)化,開發(fā)了一些靶向治療藥物,取得一些令人鼓舞的結(jié)果。EGFR突變及其分子構(gòu)象改變與靶向抑制劑的關(guān)系即是近年來在肺癌轉(zhuǎn)化研究方面突出的例子[2]。對于EGFR敏感突變的特定人群,酪氨酸蛋白激酶抑制劑吉非替尼和厄洛替尼能明顯延長晚期NSCLC患者的無復(fù)發(fā)生存期[3,4]。但這些治療手段最終都會出現(xiàn)耐藥,導(dǎo)致治

3、療失敗,歸根結(jié)底是由于對NSCLC的疾病機制不清楚。非小細胞肺癌是一種異質(zhì)性疾病,肺癌發(fā)生發(fā)展過程中存在多層次的基因表達調(diào)控異常[1],包括基因組DNA水平多種基因的體細胞遺傳變異、轉(zhuǎn)錄水平基因表達異常及轉(zhuǎn)錄本剪切異常[5]、microRNA 表達調(diào)控異常[6],進而表現(xiàn)為蛋白質(zhì)水平的功能異常。越來越多的分子表達調(diào)控異常與腫瘤特定的細胞周期、生長分化、細胞移動、凋亡調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程改變相關(guān)[7]。闡明具有驅(qū)動作用的特定基因表達調(diào)控變異機

4、制有助于闡明腫瘤特定階段生物學(xué)行為,并有助于針對變異靶點進行臨床干預(yù)。
　　 原癌基因活化是許多惡性腫瘤包括肺癌發(fā)生的一個重要機制,正常情況下,原癌基因編碼一些生長因子和受體,通過嚴密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),控制機體正常的生長與凋亡[8]。多種機制包括點突變[9]、基因融合與易位[10]、基因擴增等[11]都能導(dǎo)致原癌基因異?；罨?使細胞獲得超常的增殖能力和存活能力,從而促進腫瘤的發(fā)生。大量的分子遺傳學(xué)研究已經(jīng)顯示在肺癌中主要有以下染色體片

5、段存在擴增,包括1p(NRAS,MYCL1,PAX7)、3q(EIF4G1,TP73L,PIK3CA)、5p(SKP2)、7p(EGFR)、8q(PTK2、MYC)、11q(CCND1、BIRC2、BIRC3)和20q(E2F1)[12]。另外,如EGFR和KRAS的點突變、EML4-ALK融合基因[13]與肺癌發(fā)生的關(guān)系也已經(jīng)得到證實。與抑癌基因不同的是,癌基因發(fā)揮功能是顯性作用的,即一對等位基因其中的一個基因存在活化,就能發(fā)揮惡性轉(zhuǎn)

6、化細胞的功能。但是,這些經(jīng)典的遺傳學(xué)并不能解釋所有的現(xiàn)象,近幾年來興起的表觀遺傳學(xué)讓我們對非小細胞肺癌有了進一步的認識,如p16基因甲基化與鱗癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系,Bhutani等人還發(fā)現(xiàn)p16基因甲基化與早期肺癌的預(yù)后相關(guān),這些可遺傳的基因異常并不是由于DNA序列本身發(fā)生任何改變[14,15]。常見的表觀遺傳學(xué)修飾包括甲基化,組蛋白乙?；?近幾年來,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種新的表觀遺傳學(xué)修飾-microRNA調(diào)控,在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著

7、重要的作用[16]。
　　 微小RNA(microRNA,miRNA)分子是近年來發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控蛋白翻譯功能的內(nèi)源性非編碼RNA分子,長約22nt。最早microRNA是由Lee等在秀麗線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Lin-4[17],目前在包括人類、果蠅等多個物種鑒別出數(shù)千個microRNAs(詳見microma.sanger.ac.uk)。成熟的microRNA可通過互補或不完全互補的方式與mRNA相應(yīng)的區(qū)域結(jié)合,從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯,在轉(zhuǎn)錄后

8、水平調(diào)節(jié)靶基因的表達。多種microRNA已被證實參與白血病、淋巴瘤、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生[18-20]。MicroRNA參與腫瘤發(fā)生發(fā)展機制復(fù)雜多樣,microRNA異常表達可能上調(diào)原癌基因或下調(diào)抑癌基因,也可能因自身突變或拷貝數(shù)擴增導(dǎo)致調(diào)控功能異常。從microRNA水平探索腫瘤的異常翻譯后調(diào)控機制正成為腫瘤分子遺傳學(xué)的新的研究熱點。
　　 在肺癌研究中,已發(fā)現(xiàn)多個microRNA分子與肺癌相關(guān)。Takamizawa等

9、首次發(fā)現(xiàn)了let-7在肺癌中低表達,并且低表達的患者預(yù)后較差[21]。Johnson等確定Ras受let-7家族的調(diào)控,其中包括線蟲的RAS基因、人的KRAS、HRAS和NRAS基因,且let-7表達量與生存預(yù)后相關(guān),體外實驗也證實了過量表達let-7可抑制肺癌生長[22,23]。miR-128可直接調(diào)節(jié)表皮生長因子受體(EGFR)的水平,并與靶向藥物EGFR TKI(Gefitinib)療效相關(guān)[24]。隨著研究進展,越來越多的mic

10、roRNA分子被發(fā)現(xiàn)與肺癌發(fā)生及預(yù)后等相關(guān)。盡管肺癌相關(guān)microRNA資料越來越多,但多數(shù)microRNA異常調(diào)控的下游分子機制不清楚。
　　 如何確定microRNA調(diào)節(jié)的靶基因、并將microRNA表達變異與特定的基因表達水平變化有機的聯(lián)系起來并加以驗證是基因表達調(diào)控研究中新的課題,也是生命科學(xué)研究中一項繁重的任務(wù)。
　　 研究目的：
　　 本研究通過高通量的芯片技術(shù)篩選非小細胞肺癌與癌旁組織中差異表達的基

11、因,找到一種差異表達的基因BCL11A。接著用實時熒光定量PCR實驗和免疫組織化學(xué)技術(shù)分別在基因水平和蛋白水平驗證芯片的結(jié)果,并將BCL11A表達水平與臨床病理資料進行關(guān)聯(lián)分析,以探明其在非小細胞肺癌發(fā)生,發(fā)展中的作用。最后從基因拷貝數(shù)變化和microRNA調(diào)控兩方面探討其異常表達的機制。
　　 實驗設(shè)計
　　 1.我們選取2003-2006年在廣東省肺癌研究所接受根治性手術(shù)治療的114例非小細胞肺癌患者和其中53例癌旁

12、肺組織,應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析非小細胞肺癌與癌旁組織之間的基因表達差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)一種原癌基因BCL11A在非小細胞肺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。
　　 2.為了證實這種差異,本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR和組織芯片免疫組織化學(xué)技術(shù)分別在基因水平和蛋白水平對差異表達的基因BCL11A進行驗證,并將BCL11A表達水平與臨床病理資料和患者預(yù)后進行關(guān)聯(lián)分析,以明確BCL11A在非小細胞肺癌發(fā)生,發(fā)展中的作用。
　　 3.為了弄

13、清BCL11A在NSCLC中上調(diào)的機理,本研究借助比較基因組雜交技術(shù)以期從基因組水平了解BCL11A基因拷貝數(shù)變異情況。
　　 4.另外,近幾年發(fā)現(xiàn)的一類稱之為微小RNA(microRNA)的非編碼RNA,能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)目的基因的表達,廣泛參與非小細胞肺癌進程。本研究應(yīng)用Agilent人類microRNA表達芯片分析37對配對的非小細胞肺癌與癌旁組織之間的microRNA表達差異,找到在非小細胞肺癌組織中下調(diào)的microR

14、NAs。同時通過miRGen生物學(xué)軟件分析,找到潛在調(diào)控BCL11A的microRNA分子集,然后與在非小細胞肺癌組織中下調(diào)的microRNA分子集進行交集運行,找到在非小細胞肺癌組織中表達下調(diào)同時又是潛在調(diào)控BCL11A的microRNA分子。
　　 5.探討這些microRNA分子的功能,并在分子水平研究驗證microRNA對靶基因BCL11A的調(diào)控。
　　 初步結(jié)論
　　 1.BCL11A在非小細胞肺癌組織

15、中的表達無論是mRNA水平還是蛋白水平均明顯高于癌旁組織,提示原癌基因BCL11A在非小細胞肺癌中存在異?；罨?。
　　 2.BCL11A蛋白特異性地表達于非小細胞肺癌組織,而在癌旁正常組織中不表達,提示BCL11A蛋白可能作為一種非小細胞肺癌特異的腫瘤標志物。
　　 3.BCL11A在非小細胞肺癌中上調(diào)存在著一定的組織特異性,在鱗癌中上調(diào)最明顯。
　　 4.BCL11A mRNA水平和蛋白表達水平均與NSCLC患

16、者疾病分期和淋巴結(jié)狀態(tài)有關(guān),疾病分期為早期(Ⅰ-Ⅱ)、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的患者,BCL11A表達水平越高。
　　 5.BCL11A mRNA或BCL11A蛋白高表達的非小細胞肺癌患者無論是總生存期還是無病生存期均明顯優(yōu)于BCL11A低表達患者,BCL11A mRNA表達水平能獨立預(yù)測早期非小細胞肺癌患者術(shù)后無病生存期。而BCL11A蛋白表達水平不僅能預(yù)測早期NSCLC患者的無病生存,還能獨立預(yù)測早期NSCLC患者的術(shù)后總生存,提示BC