MTA2在食管癌組織中的表達(dá)調(diào)控及其功能機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究轉(zhuǎn)移相關(guān)基因2（MTA2）在食管癌組織中的表達(dá)及調(diào)控，和對(duì)食管癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖、遷移和侵襲能力的影響，并探討 MTA2促進(jìn)食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)正常食管上皮組織、癌旁組織和癌組織中MTA2、Sp1、miR146A、miR149、miR34A的表達(dá)，并分析MTA2與Sp1、miR146A、miR149、miR34A表達(dá)水平的相關(guān)性，同時(shí)分析MTA2的表達(dá)水

2、平與食管癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。
　　2應(yīng)用western blot和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)正常食管上皮組織和食管癌組織中MTA2蛋白的表達(dá)。
　　3應(yīng)用MTS法，Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲低MTA2對(duì)食管癌細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲能力的影響。
　　4應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲低MTA2后對(duì)EMT相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。
　　5應(yīng)用western blot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)或敲低MTA2

3、后對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。
　　6應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)敲低MTA2后對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。
　　7應(yīng)用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MTA2能否與Twist相結(jié)合。
　　8應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和western blot檢測(cè)正常食管上皮組織及癌組織中eIF4E的基因和蛋白表達(dá)水平。
　　9應(yīng)用Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)及western blot實(shí)驗(yàn)檢

4、測(cè)敲低MTA2同時(shí)過(guò)表達(dá)eIF4E對(duì)食管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響以及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。
　　10應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠移植瘤中 Ki-67和 CD31的表達(dá)情況。
　　11應(yīng)用western blot檢測(cè)裸鼠移植瘤中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與正常食管上皮組織和癌旁組織相比，食管癌組織中MTA2的表達(dá)上調(diào)（P<0.05），且食管癌組織中MTA2與S

5、p1的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.407，P<0.05)，而食管癌組織中 MTA2與 miR146A、miR149、miR34A的表達(dá)水平均無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。食管癌組織中MTA2的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、分化程度和腫瘤大小無(wú)關(guān)（P>0.05)，而與腫瘤的TNM分期和淋巴結(jié)浸潤(rùn)有關(guān)（P<0.05）。
　　2 Western blot與免疫組織化學(xué)結(jié)果均顯示，與正常食管上皮組織相比，食管癌組織中MTA2蛋白的表達(dá)水平有升

6、高的趨勢(shì)。
　　3 MTS法檢測(cè)結(jié)果顯示，敲低 MTA2能夠抑制食管癌 KYSE30與KYSE510細(xì)胞的增殖活性（P<0.05），而過(guò)表達(dá)MTA2對(duì)食管癌KYSE30與KYSE510細(xì)胞的增殖活性具有促進(jìn)作用（P<0.05）。
　　4 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低MTA2能夠抑制食管癌KYSE30與KYSE510細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P<0.05），過(guò)表達(dá)MTA2能夠促進(jìn)食管癌KYSE30與KYSE510細(xì)胞的遷移

7、和侵襲能力（P<0.05）。
　　5實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低MTA2能夠促進(jìn) E-cadherin基因和蛋白的表達(dá)（P<0.05），降低 N-cadherin、Vimentin、CD24、MYLK基因和蛋白的表達(dá)（P<0.05）；過(guò)表達(dá) MTA2能夠降低 E-cadherin基因和蛋白的表達(dá)（P<0.05），促進(jìn) N-cadherin、Vimentin、CD24、MYLK基因和蛋白的表達(dá)（

8、P<0.05）。
　　6細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低MTA2能夠促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)，降低N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。
　　7免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MTA2在食管癌細(xì)胞中能夠與Twist蛋白相結(jié)合。
　　8實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常食管上皮組織相比，食管癌組織中eIF4E的表達(dá)水平明顯增高（P<0.05），且食管癌組織中eIF4E與 MTA2的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.4

9、18，P=0.001）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常食管上皮組織相比，食管癌組織中eIF4E的蛋白表達(dá)水平也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。
　　9敲低MTA2能夠明顯降低eIF4E和p-eIF4E的表達(dá)（P<0.05）。與單獨(dú)轉(zhuǎn)染si-MTA2組相比，過(guò)表達(dá)eIF4E能夠逆轉(zhuǎn)敲低MTA2對(duì)食管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（P<0.05），并降低食管癌細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)水平（P<0.05），使N-cadherin、Vim

10、entin的表達(dá)水平升高（P<0.05）。
　　10免疫組織化學(xué)法檢測(cè)到MTA2過(guò)表達(dá)組的裸鼠移植瘤中Ki-67和CD31的表達(dá)水平均高于空載體組。
　　11 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MTA2過(guò)表達(dá)組裸鼠移植瘤與空載體組移植瘤相比，N-cadherin、Vimentin的表達(dá)有升高的趨勢(shì)，而E-cadherin的表達(dá)水平有降低的趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　食管癌中 MTA2的表達(dá)水平上調(diào)，可能與轉(zhuǎn)錄因子