候選抑癌基因BLU在食管癌細胞EC109中表達變化與功能研究.pdf

1、目的：構(gòu)建BLU基因表達載體，觀察BLU基因在食管癌細胞EC109中表達變化對食管癌細胞生長的影響，探討B(tài)LU基因在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　 方法：設(shè)計引物，用PCR法和MS-PCR法分別檢測BLU基因在EC109細胞中的缺失情況和啟動子甲基化情況。并用RT-PCR法觀察BLU在EC109細胞中的表達情況。設(shè)計引物用PCR技術(shù)克隆野生型BLU基因，將野生型基因用工具酶連接到表達載體pSL6-IRES-EGFP上，然后

2、使用感受態(tài)大腸桿菌XL-1進行擴增，提取質(zhì)粒。用脂質(zhì)體Lipfactime2000轉(zhuǎn)染EC109細胞，觀察綠色熒光表達量，并用RT-PCR和Western blot法檢測BLU在EC109細胞中在RNA和蛋白質(zhì)水平上的表達情況。應(yīng)用CCK-8法和平板克隆形成實驗，觀察BLU基因?qū)毎鲋车挠绊?。采用流式細胞術(shù)檢測細胞周期，觀察過量BLU對EC109細胞周期的影響。
　　 結(jié)果：用PCR法和MS-PCR法檢測BLU基因在EC109

3、細胞中存在缺失和啟動子甲基化的情況，且表達下調(diào)。成功克隆出野生型BLU基因并構(gòu)建出含有BLU基因的表達載體，經(jīng)測序鑒定構(gòu)建的表達載體中BLU基因無突變，用重組子轉(zhuǎn)染293T細胞熒光顯微鏡下觀察可見大量熒光表達。RT-PCR檢測EC109細胞發(fā)現(xiàn)BLU基因存在缺失，并且其啟動子區(qū)存在甲基化，BLU基因的表達降低。轉(zhuǎn)染重組子入EC109細胞，熒光顯微鏡下觀察可見大量綠色熒光，用RT-PCR法和Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組子的E

4、C109細胞中BLU基因可在RNA水平和蛋白水平大量表達。PI染色，使用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染重組子的EC109細胞和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的EC109細胞的細胞周期未發(fā)現(xiàn)顯著差異，細胞克隆形成實驗結(jié)果表明實驗組與對照組經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析（卡方檢驗）P=0.896，無顯著性差異。CCK-8檢測實驗組與對照組細胞增殖情況經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析P=0.691，無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論： BLU基因的單獨表達水平的改變對EC109細胞的增殖無顯著性作用，它可能需要