hbFGF基因修飾的組織工程化復(fù)合物修復(fù)牙周組織缺損的實驗研究.pdf

1、目的:探討堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)基因修飾的牙齦成纖維細(xì)胞(GFs)在牙周組織再生中的作用及其與骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因修飾的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)聯(lián)合應(yīng)用的效果，為基因治療與組織工程聯(lián)合應(yīng)用于牙周組織缺損再生治療提供依據(jù)。 方法:1.利用DNA重組技術(shù)，將hbFGF片段克隆到真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中，HindⅢ單酶切及序列分析鑒定獲得的重組質(zhì)粒；2.半消化法培養(yǎng)Beagle犬GFs，體外應(yīng)用

2、脂質(zhì)體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色及ELISA檢測 目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；3.體外基因轉(zhuǎn)染后，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，MTT法描繪細(xì)胞的生長曲線，AO/EB雙染色和流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡，檢測堿性磷酸酶(ALP)活性；4.通過熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡、透射電鏡及組織學(xué)進(jìn)行觀察表達(dá)目的基因的細(xì)胞與脫細(xì)胞真皮基質(zhì)ADM膜復(fù)合；5.人工構(gòu)建6只Beagle犬慢性Ⅱ度根分叉病變模型，隨機分為A、B2組。每組3只犬的

3、18顆病變牙又隨機分成3組，分別命名為用BMP-7、BMP-7/GFs和BMP-7/hbFGF治療，測量治療前后附著喪失程度，角化齦寬度變化，齦溝液中NO含量，6周、12周后取材作病理切片，H.E染色觀察牙周組織再生情況，計算新生牙骨質(zhì)長度百分比和新生牙槽骨面積百分比，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果:1.bFGF被定向插入到真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中；2.通過脂質(zhì)體介導(dǎo)成功地對Beagle犬GFs進(jìn)行了pIRES2-EGF

4、P-hbFGF瞬時轉(zhuǎn)染，24h后即可見到轉(zhuǎn)染的部分細(xì)胞發(fā)出較強的綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率為15％-25％。RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色和ELISA檢測表明，bFGF在GFs中得到了有效表達(dá)；3.目的基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)略有變化，增殖能力明顯增強，凋亡率下降，堿性磷酸酶活性無明顯改變；4.轉(zhuǎn)染細(xì)胞復(fù)合ADM膜后生長良好，24h細(xì)胞己貼附、伸展。透射電鏡可見細(xì)胞能夠在支架材料中生長，并與支架材料緊密結(jié)合；5.各組附著喪失的情況都有所改善，6周時各

5、組之間差異無顯著性；12周時BMP-7/GFs組和BMP-7/hbFGF組的改善更明顯。治療后各組角化齦寬度均有恢復(fù)，6周時，BMP-7/hbFGF組相比其它兩組治療效果更好；而12周時中BMP-7/GFs組和BMP-7/hbFGF組結(jié)果無差異，與BMP-7組相比有明顯改善。兩個時間點中各組之間治療后NO含量無明顯差異，都比治療前明顯降低。各實驗組和對照組均可見不同程度的牙周組織再生，6周時組之間差異無顯著性；12周時，BMP-7/hb

6、FGF組的新生牙槽骨面積百分比和新生牙骨質(zhì)長度百分比與其它兩組相比有明顯增加(P<0.05)。 結(jié)論:1.利用基因工程原理成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒 pIRES2-EGFP-hbFGF。 2.hbFGF基因可在GFs中有效表達(dá)。 3.hbFGF基因轉(zhuǎn)染可以促進(jìn)GFs的增值，抑制其凋亡，hbFGF基因修飾的GFs有望成為牙周組織工程理想的種子細(xì)胞。 4.hbFGF基因修飾GFs在ADM膜上生長良好，hbFGF基