組織工程方法構(gòu)建牙周組織的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、牙周疾病引起的牙周組織缺損常常導(dǎo)致牙齒缺失，嚴(yán)重影響咀嚼功能和顏面美容。如何利用再生治療方法獲得牙周新附著，恢復(fù)天然牙周組織的解剖結(jié)構(gòu)和支持功能，是國(guó)內(nèi)外學(xué)者所追求的目標(biāo)和著力研究的熱點(diǎn)課題。已開(kāi)展的牙周引導(dǎo)組織再生術(shù)、生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)及釉基質(zhì)蛋白的局部應(yīng)用等新的治療方法都取得了前所未有的效果，但尚未達(dá)到人類(lèi)所期望的目標(biāo)。隨著組織工程學(xué)理論和技術(shù)飛速發(fā)展，為牙周組織再生研究提供了新的思路。目前用組織工程學(xué)方法促進(jìn)牙周再生已經(jīng)成為這一領(lǐng)域的研

2、究熱點(diǎn)之一。 牙周膜干細(xì)胞的研究是牙周再生治療領(lǐng)域一個(gè)嶄新的課題，它對(duì)認(rèn)識(shí)牙周組織的損傷修復(fù)機(jī)理、探索新的牙周治療技術(shù)具有重要的意義。目前國(guó)際上已有人成功分離、培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞，犬及其它動(dòng)物牙周膜干細(xì)胞的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，而犬是牙周病實(shí)驗(yàn)研究最常用的動(dòng)物模型，它具有與人的同源性較高，與人的牙周結(jié)構(gòu)相似等優(yōu)點(diǎn)，因此本研究擬以犬為研究對(duì)象，采用克隆分離培養(yǎng)的方法，分離培養(yǎng)犬的牙周膜干細(xì)胞，同時(shí)對(duì)分離的犬牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行初步鑒定，

3、并將其作為種子細(xì)胞與篩選的支架材料復(fù)合分別植入裸鼠皮下和自體犬的的人工牙周缺損區(qū)，探討牙周組織再生的確切機(jī)制，為組織工程方法構(gòu)建牙周組織提供可靠的理論基礎(chǔ)和種子細(xì)胞來(lái)源。 本實(shí)驗(yàn)以人牙胚為取材來(lái)源，培養(yǎng)并鑒定了人牙囊前體細(xì)胞，以其為種子細(xì)胞篩選支架材料，建立人牙囊細(xì)胞三維立體培養(yǎng)模型，為其作為種子細(xì)胞研究牙周組織發(fā)育形成機(jī)制的研究增添了新的內(nèi)容。 本研究在成功培養(yǎng)兩種種子細(xì)胞即牙周膜干細(xì)胞和牙囊細(xì)胞的基礎(chǔ)上，優(yōu)選支架材料

4、，并與優(yōu)選的支架材料復(fù)合立體培養(yǎng)，通過(guò)前體/干細(xì)胞的分化潛能，體內(nèi)外構(gòu)建組織工程化的牙周組織樣結(jié)構(gòu)，體內(nèi)重建牙周組織修復(fù)自體犬人工牙周組織缺損，通過(guò)組織學(xué)觀察、免疫組化染色評(píng)價(jià)形成的牙周膜牙骨質(zhì)牙槽骨樣結(jié)構(gòu)，初步探討牙周組織各部分再生的機(jī)制及體內(nèi)外構(gòu)建組織工程化牙周組織的可行性，為牙周病的治療提供新的思路和途徑，為進(jìn)一步利用組織工程原理實(shí)現(xiàn)牙周再生性治療的臨床研究奠定基礎(chǔ)。 主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： 第一部分牙周組織工程

5、種子細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定 1、犬牙周膜干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和初步鑒定 目的：體外分離、培養(yǎng)和鑒定犬牙周膜干細(xì)胞。 結(jié)論：本研究成功分離培養(yǎng)犬牙周膜干細(xì)胞，該細(xì)胞具有很強(qiáng)的克隆形成能力和多向分化潛能。 2、人牙囊細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 目的：體外分離、培養(yǎng)和鑒定人牙囊間充質(zhì)前體細(xì)胞，為牙周組織工程研究提供可靠的種子細(xì)胞來(lái)源。 結(jié)論：本研究成功培養(yǎng)了人牙囊細(xì)胞；人牙囊細(xì)胞可在體外較長(zhǎng)時(shí)間保持其特性，

6、細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的某些表型特征；人牙囊細(xì)胞有望成為牙周組織工程研究的種子細(xì)胞。 第二部分牙周組織工程支架材料的優(yōu)選 目的：將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的犬牙周膜干細(xì)胞和人牙囊前體細(xì)胞作為種子細(xì)胞分別與膠原凝膠、凍干膠原膜(膠原類(lèi)材料)，煅燒骨(陶瓷化骨)，復(fù)合類(lèi)材料(膠原復(fù)合煅燒骨，)相復(fù)合進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用掃描電鏡和細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察和比較細(xì)胞在各種三維支架中的生長(zhǎng)、增值情況。 結(jié)論：膠原類(lèi)材料和陶瓷化骨的復(fù)合材料有利于牙周膜干

7、細(xì)胞和牙囊細(xì)胞的黏附、增殖和分化。 第三部分組織工程化牙周組織結(jié)構(gòu)的體內(nèi)外構(gòu)建 1、組織工程化牙周膜樣結(jié)構(gòu)的體外構(gòu)建 目的：建立犬牙周膜干細(xì)胞與膠原膜體外三維立體培養(yǎng)模型，為體內(nèi)構(gòu)建牙周組織提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，探討利用可吸收生物材料凍干膠原膜和牙周膜干細(xì)胞在體外構(gòu)建組織工程化牙周膜的可行性。 結(jié)論：利用凍干膠原膜為支架，6PDLSCs為種子細(xì)胞，可在體外成功構(gòu)建組織工程化牙周膜樣結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察提

8、供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2、組織工程化牙周膜牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的裸鼠體內(nèi)構(gòu)建 目的：建立人牙囊細(xì)胞、犬牙周膜干細(xì)胞體內(nèi)三維立體培養(yǎng)模型。 結(jié)論：牙囊細(xì)胞、犬牙周膜干細(xì)胞均可形成牙周膜牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，可作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程牙周組織和進(jìn)行牙周組織修復(fù)和再生機(jī)制研究。 3、組織工程方法體內(nèi)重建牙周組織的實(shí)驗(yàn)研究 目的：以犬自體牙周膜干細(xì)胞為種子細(xì)胞，凍干膠原膜、膠原凝膠煅燒骨為支架，復(fù)合后植入自體犬的人工牙周缺損處