組織工程化尿道構建及尿道缺損修復的實驗性研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　先天性尿道下裂以及尿道外傷、腫瘤、尿道狹窄等疾病的發(fā)生目前有逐年增高趨勢，其有效解決辦法還依賴于外科手術治療。傳統(tǒng)的外科手術處理，多應用自身包皮、陰囊組織原位修復，或者應用頰粘膜、膀胱粘膜等自體組織移植修復處理。但明顯的缺陷就是容易并發(fā)術后尿道瘺、尿道再狹窄、尿道結石等，且對于再次手術、尿道缺損較長的病例，容易因自身修復材料不足而令臨床醫(yī)生產生治療上的無奈。
　　隨著醫(yī)學技術和相關學科的發(fā)展，組織工程學

2、首先在骨科及皮膚科等領域出現(xiàn)并取得了一定的研究進展。這也為目前面臨的尿道修復材料來源難題提供了一種全新的解決思路。目前國內外學者已經進行了該領域的實驗性研究及少部分臨床應用的嘗試，取得了一定成就，也不同程度地暴露出了一些問題和弊端。特別是在種子細胞的選擇方面，仍存在不少爭議。
　　研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有多向分化潛能，可定向分化為外胚層的神經

3、元和神經膠質細胞、中胚層的成骨細胞和脂肪細胞、內胚層的肝細胞等。BMSCs具備與 ECM的良好生物相容性，在組織工程研究中得到了廣泛的應用，并首先在組織工程骨組織的構建試驗中取得了很大的成功。另有研究證實，干細胞與尿道上皮細胞的直接接觸可以誘導其向尿路上皮定向分化，但具體機制尚不明確。BMSCs的體外分離與培養(yǎng)主要采用以下幾種方式：①貼壁篩選法；②密度梯度離心法；③免疫磁珠篩選法；④流式細胞儀分選法。
　　尿路上皮細胞是較難培養(yǎng)的

4、上皮細胞之一，既往人們曾經認為尿路上皮細胞會自然衰老凋亡，正常的尿路上皮細胞可以在體外存活，但時間短，很難在體外培養(yǎng)、傳代，且無證據(jù)表明細胞有數(shù)量的增加。隨著細胞培養(yǎng)技術的不斷完善和細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化，尿路上皮細胞的培養(yǎng)研究逐步展開并不斷獲得成功。動物實驗表明，膀胱來源的尿路上皮細胞可在體外培養(yǎng)傳代至3~12代。國外的研究隨后證實，人膀胱移行上皮細胞的體外培養(yǎng)方面的研究也獲得了成功。膀胱來源的尿路上皮細胞的分離方法有酶消化法、組織塊法及

5、刮削法3種。
　　本實驗擬通過應用干細胞（骨髓間充質干細胞）和成體細胞（尿路上皮細胞）聯(lián)合脫細胞基質材料的體外培養(yǎng)，并應用于長段尿道缺損的修復研究。通過比較實驗結果，以期尋找更為理想的種子細胞，進一步推動尿道組織工程的發(fā)展。
　　方法：
　　1.種子細胞的制備、篩選及鑒定
　　1.1骨髓間充質干細胞的制備、篩選與鑒定
　　選取雄性新西蘭白兔為實驗對象，抽取雙下肢骨髓，利用密度梯度離心法分離提取骨髓間充質干細

6、胞，體外培養(yǎng)、擴增、傳代。應用流式細胞儀檢測細胞表面CD34、CD44的表達，鑒定確認為骨髓間充質干細胞。將其作為實驗用種子細胞之一。
　　1.2尿路上皮細胞的制備、篩選與鑒定
　　以雄性新西蘭白兔為實驗動物，機械分離法及酶消化法分離提取膀胱黏膜組織中的尿路上皮細胞，進行體外培養(yǎng)、傳代。應用免疫熒光法鑒定尿路上皮細胞表面特異性表達因子及標記物——細胞角蛋白-18（CK-18）與和尿溶蛋白-2（UP2）的表達水平，鑒定確認尿路

7、上皮細胞，并作為另外一種實驗用種子細胞。
　　2.種子細胞—脫細胞基質材料的復合培養(yǎng)與標記
　　2.1骨髓間充質干細胞（BMSC）—脫細胞基質的制備
　　選取培養(yǎng)傳代后已接近90％融合的第4代BMSC，加入含有0.2%5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）的無血清低糖 DMEM溶液培養(yǎng)標記，然后應用移液器將制備好的細胞懸液均勻滴加到脫細胞基質粘膜面。聯(lián)合培養(yǎng)制備復合材料備用。
　　2.2尿路上皮細胞—脫細胞基質的制備<

8、br>　　選取傳代培養(yǎng)后已接近90%融合的第4代尿路上皮細胞備用，0.2%5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）共同培養(yǎng)標記。應用移液器將制備好的細胞懸液均勻滴加到脫細胞基質粘膜面，聯(lián)合培養(yǎng)制備復合材料備用。
　　3.尿道缺損模型的制作與修復
　　3.1尿道缺損模型的制作
　　全麻下游離雄性新西蘭白兔尿道，切除中段尿道長約3cm，人工制作尿道缺損動物模型，備用。
　　3.2尿道缺損的修復
　　56只雄性成年新西蘭

9、兔，應用隨機數(shù)字法分組，分為4組，每組14只。具體分組及修復操作如下：
　　A組(無細胞對照組)即：單純應用異種脫細胞基質修復組。應用空白脫細胞基質材料直接制作管狀尿道，用于尿道缺損模型的尿道修復與重建；
　　B組（假手術組）即：假手術對照組。尿道缺損模型制作成功后，將尿道缺損后的兩個尿道斷端直接行端端吻合，恢復尿道連續(xù)性；
　　C組（BMSCs組）即：BMSC復合異種脫細胞基質手術修復組。將BMSCs聯(lián)合脫細胞基質材

10、料聯(lián)合培養(yǎng)后，用于尿道缺損模型的尿道修復與重建，作為實驗組之一；
　　D組（尿路上皮細胞組）即：為尿路上皮細胞復合脫細胞基質手術修復組。將尿路上皮細胞聯(lián)合脫細胞基質材料聯(lián)合培養(yǎng)后，用于尿道缺損模型的尿道修復與重建，作為另一實驗組。
　　結果：
　　1．BMSCs呈貼壁式生長，由短梭形逐漸演變?yōu)殚L梭形外觀。應用流式細胞儀檢測傳代至第4代的BMSC，可見其表達CD44陽性，而CD34的表達則為陰性，符合間充質干細胞特征；<

11、br>　　2．尿路上皮細胞呈貼壁式生長，呈圓形、類圓形外觀，逐漸融合形成鋪路石樣外觀。免疫熒光實驗結果顯示所培養(yǎng)的細胞表達CK-18與UP2呈陽性；
　　3．BMSCs及尿路上皮細胞接種后脫細胞基質材料透明度降低，細胞均呈集落樣生長，形成網狀結構。
　　4．四組試驗動物均全部存活，B組修復后恢復最為順利，A組修復效果最差，C、D組實驗動物觀察至術后12周修復效果相當，經統(tǒng)計學檢驗處理，兩組差異無統(tǒng)計學意義。
　　結論：