兩個ZmZF等位基因的分型及表達研究.pdf

1、在玉米不同自交系基因組間存在著豐富的SNPs(singlenucleotidepolymorphisms)和InDels(insertion/deletionpolymorphisms)，這為開發(fā)SNP分子標記、鑒別不同等位基因型提供了便利。目前已有多種檢測SNP的方法，其中等位基因特異PCR(Allele-specificPCR，AS-PCR)是近年來開發(fā)的一種基于PCR技術(shù)的快速、簡便、費用低廉的檢測等位基因型的技術(shù)，但是因其特異引

2、物3’端的第一個堿基有可能與模板錯配從而影響了檢測結(jié)果的可靠性。為了準確地檢測玉米的等位基因型，可以根據(jù)玉米基因組豐富的SNPs和InDels設(shè)計同時包含多個SNP和InDel位點的等位基因特異PCR引物，這種引物可以克服單個SNP或InDel位點可能存在著錯配的缺點來準確地檢測玉米等位基因型，并進一步檢測等位基因在雜交種中的表達情況。 為了驗證利用該方法是否可以方便、準確地檢測玉米等位基因型，并檢測等位基因在雜交種中的表達情況

3、。本課題以一個淹水脅迫后在自交系Mo17和Hz32之間存在著表達差異的基因ZmZF為例來開展研究，旨在建立一種快捷準確的鑒別等位基因型以及檢測等位基因在雜交種中表達的方法。研究結(jié)果如下： (1)根據(jù)已經(jīng)公布的ZmZF基因cDNA序列設(shè)計的引物在兩個親本材料受水淹處理后的cDNA中擴增出了大部分ZmZF基因cDNA中的3’UTR和一小部分的編碼區(qū)序列，在這兩個部分序列間共包含了3個SNP位點和3個InDel位點。 (2)根

4、據(jù)等位基因特異PCR方法的原理，把SNP和InDel位點分別設(shè)計在正反分型引物中，然后用這些引物進行PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物來鑒別ZmZF-Mo17和ZmZF-Hz32基因型的cDNA模板。通過比較，初步篩選到了包含SNP位點的正向引物Pa、Pg和包含InDel位點的反向引物Ph、Pm能夠準確地區(qū)分出這兩種等位基因型。進一步地對這兩對分型引物在不同Mg2+和dNTP濃度下的穩(wěn)定性作了檢測，發(fā)現(xiàn)這兩對分型引物在一定濃度范圍

5、內(nèi)都能穩(wěn)定地區(qū)分這兩種等位基因型。另外用實時熒光定量PCR方法檢測也能夠準確地鑒別出這兩種等位基因型。這些結(jié)果說明結(jié)合了SNP和InDel位點的分型引物比只包含一個SNP位點的分型引物檢測的準確性強，利用該引物可以快捷準確地進行玉米基因分型和等位基因在雜交種中的表達檢測。 (3)用分型引物做半定量RT-PCR檢測ZmZF等位基因在雜交種以及兩個親本根系中的表達發(fā)現(xiàn)：在雜交種中與在親本中一樣，與0h的對照相比，在淹水脅迫后，ZmZ

6、F-Mo17表達量明顯升高，而ZmZF-Hz32表達量比較穩(wěn)定，并且比ZmZF-Mo17低。水淹8h后的不同材料的葉片用半定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)這兩個等位基因在葉片中的表達和根系中一樣也存在著差異。用分型引物做實時熒光定量PCR檢測后發(fā)現(xiàn)：兩個等位基因在雜交種中的表達與在兩親本中一樣存在著差異，但淹水脅迫24h后，在雜交種中ZmZF-Mo17的表達量較16h少。這些結(jié)果表明：在淹水脅迫下，玉米雜交種中也存在著等位基因表達的差異，這種差