兩個油菜NAC基因的鑒定及其表達(dá)和功能的初步研究.pdf

1、油菜（Brassica napus）屬于十字花科，是一種重要的油料作物。油菜籽是我國對外貿(mào)易中的大型農(nóng)產(chǎn)品之一。因此，研究油菜在脅迫環(huán)境中的表達(dá)情況及分子調(diào)控機(jī)制，對于提高油菜產(chǎn)量具有十分重要意義。NAC轉(zhuǎn)錄因子是近十幾年來發(fā)現(xiàn)的一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，迄今為止，在其他真核生物中還未發(fā)現(xiàn)同源物，其主要特征是含有一個十分保守的DNA結(jié)合部位的N端部分和一個高度變異且具有轉(zhuǎn)錄激活功能的C端部分。N端部分又可以劃分為五個子結(jié)構(gòu)域(A，B，C，

2、D，E)，其中A、C、D高度保守，B和E保守性不強(qiáng)。NAC轉(zhuǎn)錄因子不僅在植物生長發(fā)育和器官建成過程中有重要的影響，而且在激素調(diào)節(jié)和防御抵抗多種生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用。本文從油菜中克隆鑒定了兩個NAC基因，分別命名為BnNAC2和BnNAC5，并對這兩個基因的表達(dá)及功能進(jìn)行了研究探討，取得如下主要結(jié)果：
　　 1.油菜BnNAC2和BnNACS基因在NaCl，Mannitol，ABA脅迫處理下的誘導(dǎo)表達(dá)
　　

3、 為了研究油菜中的NAC基因，我們通過生物信息學(xué)的方法，找到了六個油菜的NAC基因，并命名為BnNACl-6。首先通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析了這六個基因在鹽脅迫、干旱，ABA脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果表明，BnNAC2和BnNAC5這兩個基因在一定時(shí)間范圍內(nèi)的表達(dá)受到鹽，甘露醇（模擬干旱）以及ABA的誘導(dǎo)較顯著。這些結(jié)果說明BnNAC2和BnNAC5可能參與植物體對鹽、干旱和ABA的脅迫應(yīng)答，同時(shí)也間接說明干旱和高鹽脅迫信號以及干旱與AB

4、A信號通路之間可能存在著交叉。
　　 2.油菜BnNAC2和BnNAC5基因的分離鑒定
　　 從油菜cDNA中分離克隆了這兩個2個油菜NAC基因：BnNAC2和BnNAC5。其后，用PCR的方法從油菜基因組中分離了BnNAC2和BnNAC5基因的DNA全長序列，通過全長分析發(fā)現(xiàn)均含有3個外顯子和2個內(nèi)含子。對同類NAC蛋白的比較分析表明，BnNAC2/5基因的編碼蛋白的N端非常保守，并可以分為五個亞結(jié)構(gòu)域，而C端則表現(xiàn)為

5、高度多樣性。
　　 3.油菜BnNAC2和BnNAC5基因在不同組織中的表達(dá)模式
　　 提取油菜不同組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)分別對BnNAC2和BnNAC5基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示BnNAC2/5在各個組織中均有表達(dá)，BnNAC2在花組織中表達(dá)量最高，BnNAC5在莖中表達(dá)量最高。同時(shí)我們分離了BnNAC2基因的啟動子，構(gòu)建了BnNAC2promoter::GUS融合表達(dá)載體

6、，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥，利用GUS組織化學(xué)分析技術(shù)研究BnNAC2啟動子在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的活性，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)模式與RT-PCR結(jié)果一致?？偟膩碚f，以上結(jié)果表明這兩個基因可能在油菜的不同組織器官發(fā)育中發(fā)揮作用。
　　 4.油菜BnNAC2和BnNAC5蛋白的轉(zhuǎn)錄激活分析
　　 將油菜BnNAC2和BnNAC5基因構(gòu)建到PGBKT7載體中，分別轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109和Y187，分析其轉(zhuǎn)錄自激活活性。結(jié)果表明，BnNA

7、C2蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活功能，而BnNAC5不具備轉(zhuǎn)錄激活功能，推測BnNAC5可能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。
　　 5.在轉(zhuǎn)裂殖酵母中過量表達(dá)BnNAC2和BnNACS基因增強(qiáng)了細(xì)胞對鹽和干旱的敏感性
　　 將BnNAC2和BnNAC5基因構(gòu)建在PREP5N載體上，導(dǎo)入裂殖酵母，進(jìn)行這兩個基因的過量表達(dá)分析。通過在不同的培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，結(jié)果表明，誘導(dǎo)BnNAC2和BnNAC5基因的表達(dá)將會導(dǎo)致酵母細(xì)胞