褐盤二孢兩專化型侵染過程中黑楊基因表達及內生真菌關系.pdf

1、楊生褐盤二孢菌（Marssonina brunnea）在楊屬的不同寄主上存在兩個?；?，從形態(tài)特征和現(xiàn)有的一些核酸分子序列標記上不易區(qū)分。研究病原菌在侵染寄主過程中對寄主的作用機理，分析兩?；途甑牟町愋?，同時對楊樹葉片上的內生真菌種類進行調查，分析其與楊樹黑斑病的關系。應用新的技術手段對病原菌的鑒定以及其與寄主的互作關系研究提供了新方向。
　　本研究采集病原菌材料樣本及健康葉片材料，組織分離得到病原菌和內生菌菌株，總DNA為模

2、板進行PCR擴增ITS序列。聯(lián)合盤二孢屬核糖體轉錄間隔區(qū)(ITS)序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹和ITS2的二級結構，來區(qū)分這兩個專化型。采用離體葉片接種病原菌孢子，篩選出致病性強的?；途辍Ｔ賹⒑Y選出的菌株接種到黑楊盆栽苗葉片上，利用熒光顯微鏡觀察菌株孢子侵染葉片的過程，選出孢子侵染葉片的時間節(jié)點，應用Real-timePCR檢測分析在這幾個時間節(jié)點寄主的相關基因表達情況。
　　結果表明:(1)分離得到的內生真菌主要包括37個屬，257

3、株菌株，其中優(yōu)勢菌群為鏈格孢屬（Alternaria）、假尾孢菌屬（Pseudocercospora）、葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）、暗球腔菌屬（Phaeosphaeria）。同時篩選出兩株菌株對病原菌生長有抑制作用。
　　(2)在寄主葉片上挑取的病原菌孢子形態(tài)比較典型，而在培養(yǎng)基上培養(yǎng)的孢子形態(tài)差異較大，我們不能依據(jù)傳統(tǒng)的芽管萌發(fā)數(shù)有效區(qū)分兩個專化型。三種構建的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹的方法只能說明盤二孢屬3個種的種

4、間關系，卻無法將參考ITS序列準確定位到?；椭小Ｔ贗TS2二級結構預測模型中，通過比較盤二孢屬ITS2二級結構發(fā)現(xiàn):M.rosae和M.coronariae種內的菌株以及包括參考ITS序列在內的M.brunnea同一專化型的ITS2二級結構模型完全相同，但在這三個種之間及M.brunnea兩專化型之間，ITS2二級結構上有多個位點的堿基差異，且種內?；痛嬖贑BCs配對堿基差異。因此，應用ITS2二級結構和系統(tǒng)發(fā)育樹可以更有效地作為楊

5、生褐盤二孢菌兩個?；蛥^(qū)分的分子依據(jù)。
　　(3)楊生褐盤二孢兩?；途甑逆咦釉诮臃N后的三個時間點2h、24h、96h分別對應孢子的剛剛萌發(fā)，長出附著孢，產(chǎn)生鮮菌絲。熒光定量PCR結果表明:目的基因PR5在這三個節(jié)點上均上調表達;PR10在兩個樣本中均表現(xiàn)為接種后2h表達量迅速增高，而后降低;NPR1在H樣本中先少量上調表達，24h下調表達，96h又上調表達到2h表達水平，與之相比較B樣品在接種后上調表達量逐漸升高;PtrWRK