褐盤二孢兩專化型侵染過程中黑楊基因表達(dá)及內(nèi)生真菌關(guān)系.pdf

1、楊生褐盤二孢菌（Marssonina brunnea）在楊屬的不同寄主上存在兩個專化型，從形態(tài)特征和現(xiàn)有的一些核酸分子序列標(biāo)記上不易區(qū)分。研究病原菌在侵染寄主過程中對寄主的作用機(jī)理，分析兩專化型菌株的差異性，同時對楊樹葉片上的內(nèi)生真菌種類進(jìn)行調(diào)查，分析其與楊樹黑斑病的關(guān)系。應(yīng)用新的技術(shù)手段對病原菌的鑒定以及其與寄主的互作關(guān)系研究提供了新方向。
　　本研究采集病原菌材料樣本及健康葉片材料，組織分離得到病原菌和內(nèi)生菌菌株，總DNA為模

2、板進(jìn)行PCR擴(kuò)增ITS序列。聯(lián)合盤二孢屬核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹和ITS2的二級結(jié)構(gòu)，來區(qū)分這兩個?；?。采用離體葉片接種病原菌孢子，篩選出致病性強(qiáng)的專化型菌株。再將篩選出的菌株接種到黑楊盆栽苗葉片上，利用熒光顯微鏡觀察菌株孢子侵染葉片的過程，選出孢子侵染葉片的時間節(jié)點，應(yīng)用Real-timePCR檢測分析在這幾個時間節(jié)點寄主的相關(guān)基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果表明:(1)分離得到的內(nèi)生真菌主要包括37個屬，257

3、株菌株，其中優(yōu)勢菌群為鏈格孢屬（Alternaria）、假尾孢菌屬（Pseudocercospora）、葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）、暗球腔菌屬（Phaeosphaeria）。同時篩選出兩株菌株對病原菌生長有抑制作用。
　　(2)在寄主葉片上挑取的病原菌孢子形態(tài)比較典型，而在培養(yǎng)基上培養(yǎng)的孢子形態(tài)差異較大，我們不能依據(jù)傳統(tǒng)的芽管萌發(fā)數(shù)有效區(qū)分兩個專化型。三種構(gòu)建的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹的方法只能說明盤二孢屬3個種的種

4、間關(guān)系，卻無法將參考ITS序列準(zhǔn)確定位到?；椭小Ｔ贗TS2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型中，通過比較盤二孢屬ITS2二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn):M.rosae和M.coronariae種內(nèi)的菌株以及包括參考ITS序列在內(nèi)的M.brunnea同一?；偷腎TS2二級結(jié)構(gòu)模型完全相同，但在這三個種之間及M.brunnea兩?；椭g，ITS2二級結(jié)構(gòu)上有多個位點的堿基差異，且種內(nèi)?；痛嬖贑BCs配對堿基差異。因此，應(yīng)用ITS2二級結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育樹可以更有效地作為楊

5、生褐盤二孢菌兩個?；蛥^(qū)分的分子依據(jù)。
　　(3)楊生褐盤二孢兩專化型菌株的孢子在接種后的三個時間點2h、24h、96h分別對應(yīng)孢子的剛剛萌發(fā)，長出附著孢，產(chǎn)生鮮菌絲。熒光定量PCR結(jié)果表明:目的基因PR5在這三個節(jié)點上均上調(diào)表達(dá);PR10在兩個樣本中均表現(xiàn)為接種后2h表達(dá)量迅速增高，而后降低;NPR1在H樣本中先少量上調(diào)表達(dá)，24h下調(diào)表達(dá)，96h又上調(diào)表達(dá)到2h表達(dá)水平，與之相比較B樣品在接種后上調(diào)表達(dá)量逐漸升高;PtrWRK