CD105基因沉默對BN大鼠脈絡膜新生血管形成的影響.pdf

1、脈絡膜新生血管(Choroidal Neovascularization，CNV)也稱視網膜下新生血管，是由多種病因所致的脈絡膜新生血管芽穿越bruch膜并在視網膜色素上皮下和/或上增殖形成的纖維血管組織，由于管壁的通透性高于正常血管，常伴有黃斑部視網膜下的漿液性滲出和出血，繼而可形成瘢痕，造成黃斑部損傷，嚴重影響中心視力，甚至致盲。以CNV為主要病理特征的年齡相關性黃斑變性目前已成為國內外老年人群中首要的致盲性眼病。如何有效的抑制CN

2、V的形成和生長是多年來一直困擾眼科學界的難題和研究熱點。 CNV的確切發(fā)病機制尚未闡明，缺乏理想的防治手段。目前抑制或消退CNV的途徑有激光光凝、光動力療法(PDT)、經瞳孔溫熱療法(TTT)、手術剝除及放射治療，但治療效果不盡如人意，或復發(fā)率高，或不可避免損傷正常組織結構，造成視功能進一步惡化。 基因治療已經成為目前CNV治療的前沿和希望。目前拮抗血管內皮生長因子(Vascular endothelial growt

3、h factor，VEGF)藥物在臨床實踐中取得了令人鼓舞的效果。但由于VEGF及其受體具有分布廣泛、生理功能復雜的特點，其一定水平的表達對眼內光感受器的生存和維持脈絡膜血管對視網膜的血供是必要的，長期抑制VEGF在眼內的表達可能會有不利的后果。所以尋找更安全有效的治療靶點勢在必行。 CD105作為tGF-β的受體高度表達于增生活躍的血管內皮細胞表面，而正常血管內皮細胞無或微弱表達CD105，因此CD105常被作為增生活躍的內

4、皮細胞標記物。研究表明CD105基因在新生血管形成中是必須的。在CNV的形成中可能起重要作用，也可能成CNV治療的靶分子之一。 目的： 1.建立激光誘導BN(Brown Norway)大鼠脈絡膜新生血管模型，研究VEGF和CD105基因在CNV形成中的表達。 2.使用Pgenesil-1質粒構建CD105RNA干擾重組體，在激光誘導BN(Brown Norway)大鼠脈絡膜新生血管模型中，篩選高效特異抑制CD10

5、5基因表達的短發(fā)夾樣shmYA。 3.研究在激光誘導BN(Brown Norway)大鼠脈絡膜新生血管模型中，因CD105基因表達沉默后對CNV形成及VEGF基因表達的影響。 方法： 1.建立BN大鼠CNV模型：采用半導體激光光凝BN大鼠單眼的視網膜作為實驗組，于光凝后1h，第3，7，14，21，28d行眼底血管熒光素造影(fundus nuorescein angiography，FFA)檢查，并于第14d行病

6、理組織學檢查和脈絡膜鋪片，觀察CNV的形成情況。 2.采用免疫組化和RT-PCR方法檢測CD105基因在CNV模型和對照組中的表達并探討其與CNV形成的關系。 根據CD105基因序列信息設計了3條shRYA以及一條非特異陰性序列，利用含U6啟動子的表達質粒成功構建其RNA干擾重組體。采用視網膜下注射的方法使shRNA表達質粒轉染大鼠視網膜和脈絡膜，觀察質粒所攜帶GFP基因表達情況。根據不同的表達質粒對BN大鼠CNV模型2

7、wk時CD105基因mRNA表達的抑制效果與空白對照及僅加轉染試劑組比較分析，篩選有效的抑制序列。 3.采用視網膜下注射的方法使高效CD105shRNA表達質粒轉染大鼠視網膜和脈絡膜，采用FFA檢查和脈絡膜鋪片的方法觀察CD105基因沉默對BN大鼠CNV形成的影響。采用RT-PCR檢測實驗組CD105基因沉默后VEGF基因mRNA表達情況，并與對照組進行比較。 結果： 1.采用半導體激光光凝BN大鼠視網膜的方法可

8、以成功誘導CNV的形成，FFA證實光凝后第7d開始形成CNV，第14d有大量CNV形成，CNV可持續(xù)至4wk。脈絡膜鋪片及光鏡檢查均證實光凝后2wkCNV形成。 2.采用免疫組化和RT-PCR方法均發(fā)現CD105基因在空白對照組大鼠視網膜及脈絡膜無或僅有微弱表達。光凝后1wk光凝區(qū)出現散在孤立的陽性染色，1-3wk，隨著光凝后時間的延長CD105陽性表達物逐漸增多，4wk時較3wk略有減少。CD105陽性染色IOD1wk與2wk

9、，3wk和4wk比較差異有顯著性(P<0.01)。但2wk，3wk和4wk之間陽性染色IOD比較差異無顯著性(P>0.05)。 3.基因測序證實目的序列成功插入質粒Pgenesil-1預定位置，構建了3條CD105shRNA和陽性對照Pgenesil-HK。 熒光顯微鏡下發(fā)現質粒Pgenesil-1在治療眼1d即可見明顯的綠色熒光分布于視網膜全層包括RPE細胞層，并沿視網膜下腔成功轉染了更遠處的外層視網膜細胞。2～3wk

10、熒光強度比1wk增強，熒光范圍也有所擴大，可以持續(xù)表達4wk。空白對照眼無GFP表達。利用脂質體成功介導Pgenesil-1轉染至視網膜全層的細胞，包括視網膜色素上皮細胞，且GFP有較高水平表達。 研究發(fā)現不同的質粒轉染后對CD105在CNV高峰期的表達干預效果不同。Pgenesil-eng2和Pgenesil-eng3可明顯抑制CNV模型在2wk時CD105mRNA的表達，抑制效率分別為78±5％，(P<0.01)；52±3％

11、，(P<0.05)。其他組的CD10.RNA表達水平無明顯變化。Pgenesil-eng2具有較強的基因沉默效果。 4.FFA顯示光凝后第14d時，對照組的熒光滲漏率為63.2％，實驗組為24.6％。實驗組的BN大鼠眼底滲漏點數較對照組少，滲漏強度較弱。兩組間比較右顯著性差異。脈絡膜鋪片結果顯示：2wk時對照組大鼠的CNV面積為(31.22±1.46)103μm2，實驗組大鼠的CNV滲漏面積為(14.46±0.82)103μm2

12、，兩組間比較右顯著性差異。 RT-PCR結果顯示：光凝后7d，VEGF mRNA的表達處于高峰，2wk后表達開始下降，4wk明顯減弱。實驗組VEGF mRNA的表達變化規(guī)律與對照組相似，單各個時間的表達量較對照組均明顯下降，其中2wk時實驗組約為對照組的36.7％。對照組BN大鼠眼球在轉染后第1wk CD10.mRNA表達開始升高，第2、3wk表達強度更強，到第4wk其視網膜組織中CD105mRNA表達水平開始降低。實驗組CD

13、105mRNA表達的變化趨勢與對照組一致，但各個時間點上的表達水平明顯降低。其中第2wk實驗組約為對照組的21.68％。 結論： 1.半導體激光光凝視網膜可以成功地建立BN大鼠CNV模型，成模時間短，成模率高，效果可靠。 2.CD105基因的表達規(guī)律與CNV的形成過程一致，CD105基因是CNV的重要分子標志。 3.在陽離子脂質體輔助下，Pgenesil-1質?？梢猿晒Φ貙⒛康幕蜣D染至大鼠視網膜各層次，