CD105基因沉默對(duì)BN大鼠脈絡(luò)膜新生血管形成的影響.pdf

1、脈絡(luò)膜新生血管(Choroidal Neovascularization，CNV)也稱視網(wǎng)膜下新生血管，是由多種病因所致的脈絡(luò)膜新生血管芽穿越bruch膜并在視網(wǎng)膜色素上皮下和/或上增殖形成的纖維血管組織，由于管壁的通透性高于正常血管，常伴有黃斑部視網(wǎng)膜下的漿液性滲出和出血，繼而可形成瘢痕，造成黃斑部損傷，嚴(yán)重影響中心視力，甚至致盲。以CNV為主要病理特征的年齡相關(guān)性黃斑變性目前已成為國(guó)內(nèi)外老年人群中首要的致盲性眼病。如何有效的抑制CN

2、V的形成和生長(zhǎng)是多年來(lái)一直困擾眼科學(xué)界的難題和研究熱點(diǎn)。 CNV的確切發(fā)病機(jī)制尚未闡明，缺乏理想的防治手段。目前抑制或消退CNV的途徑有激光光凝、光動(dòng)力療法(PDT)、經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?TTT)、手術(shù)剝除及放射治療，但治療效果不盡如人意，或復(fù)發(fā)率高，或不可避免損傷正常組織結(jié)構(gòu)，造成視功能進(jìn)一步惡化。 基因治療已經(jīng)成為目前CNV治療的前沿和希望。目前拮抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growt

3、h factor，VEGF)藥物在臨床實(shí)踐中取得了令人鼓舞的效果。但由于VEGF及其受體具有分布廣泛、生理功能復(fù)雜的特點(diǎn)，其一定水平的表達(dá)對(duì)眼內(nèi)光感受器的生存和維持脈絡(luò)膜血管對(duì)視網(wǎng)膜的血供是必要的，長(zhǎng)期抑制VEGF在眼內(nèi)的表達(dá)可能會(huì)有不利的后果。所以尋找更安全有效的治療靶點(diǎn)勢(shì)在必行。 CD105作為tGF-β的受體高度表達(dá)于增生活躍的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，而正常血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)或微弱表達(dá)CD105，因此CD105常被作為增生活躍的內(nèi)

4、皮細(xì)胞標(biāo)記物。研究表明CD105基因在新生血管形成中是必須的。在CNV的形成中可能起重要作用，也可能成CNV治療的靶分子之一。 目的： 1.建立激光誘導(dǎo)BN(Brown Norway)大鼠脈絡(luò)膜新生血管模型，研究VEGF和CD105基因在CNV形成中的表達(dá)。 2.使用Pgenesil-1質(zhì)粒構(gòu)建CD105RNA干擾重組體，在激光誘導(dǎo)BN(Brown Norway)大鼠脈絡(luò)膜新生血管模型中，篩選高效特異抑制CD10

5、5基因表達(dá)的短發(fā)夾樣shmYA。 3.研究在激光誘導(dǎo)BN(Brown Norway)大鼠脈絡(luò)膜新生血管模型中，因CD105基因表達(dá)沉默后對(duì)CNV形成及VEGF基因表達(dá)的影響。 方法： 1.建立BN大鼠CNV模型：采用半導(dǎo)體激光光凝BN大鼠單眼的視網(wǎng)膜作為實(shí)驗(yàn)組，于光凝后1h，第3，7，14，21，28d行眼底血管熒光素造影(fundus nuorescein angiography，F(xiàn)FA)檢查，并于第14d行病

6、理組織學(xué)檢查和脈絡(luò)膜鋪片，觀察CNV的形成情況。 2.采用免疫組化和RT-PCR方法檢測(cè)CD105基因在CNV模型和對(duì)照組中的表達(dá)并探討其與CNV形成的關(guān)系。 根據(jù)CD105基因序列信息設(shè)計(jì)了3條shRYA以及一條非特異陰性序列，利用含U6啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒成功構(gòu)建其RNA干擾重組體。采用視網(wǎng)膜下注射的方法使shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜，觀察質(zhì)粒所攜帶GFP基因表達(dá)情況。根據(jù)不同的表達(dá)質(zhì)粒對(duì)BN大鼠CNV模型2

7、wk時(shí)CD105基因mRNA表達(dá)的抑制效果與空白對(duì)照及僅加轉(zhuǎn)染試劑組比較分析，篩選有效的抑制序列。 3.采用視網(wǎng)膜下注射的方法使高效CD105shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜，采用FFA檢查和脈絡(luò)膜鋪片的方法觀察CD105基因沉默對(duì)BN大鼠CNV形成的影響。采用RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組CD105基因沉默后VEGF基因mRNA表達(dá)情況，并與對(duì)照組進(jìn)行比較。 結(jié)果： 1.采用半導(dǎo)體激光光凝BN大鼠視網(wǎng)膜的方法可

8、以成功誘導(dǎo)CNV的形成，F(xiàn)FA證實(shí)光凝后第7d開(kāi)始形成CNV，第14d有大量CNV形成，CNV可持續(xù)至4wk。脈絡(luò)膜鋪片及光鏡檢查均證實(shí)光凝后2wkCNV形成。 2.采用免疫組化和RT-PCR方法均發(fā)現(xiàn)CD105基因在空白對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜無(wú)或僅有微弱表達(dá)。光凝后1wk光凝區(qū)出現(xiàn)散在孤立的陽(yáng)性染色，1-3wk，隨著光凝后時(shí)間的延長(zhǎng)CD105陽(yáng)性表達(dá)物逐漸增多，4wk時(shí)較3wk略有減少。CD105陽(yáng)性染色I(xiàn)OD1wk與2wk

9、，3wk和4wk比較差異有顯著性(P<0.01)。但2wk，3wk和4wk之間陽(yáng)性染色I(xiàn)OD比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。 3.基因測(cè)序證實(shí)目的序列成功插入質(zhì)粒Pgenesil-1預(yù)定位置，構(gòu)建了3條CD105shRNA和陽(yáng)性對(duì)照Pgenesil-HK。 熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒Pgenesil-1在治療眼1d即可見(jiàn)明顯的綠色熒光分布于視網(wǎng)膜全層包括RPE細(xì)胞層，并沿視網(wǎng)膜下腔成功轉(zhuǎn)染了更遠(yuǎn)處的外層視網(wǎng)膜細(xì)胞。2～3wk

10、熒光強(qiáng)度比1wk增強(qiáng)，熒光范圍也有所擴(kuò)大，可以持續(xù)表達(dá)4wk?？瞻讓?duì)照眼無(wú)GFP表達(dá)。利用脂質(zhì)體成功介導(dǎo)Pgenesil-1轉(zhuǎn)染至視網(wǎng)膜全層的細(xì)胞，包括視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，且GFP有較高水平表達(dá)。 研究發(fā)現(xiàn)不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)CD105在CNV高峰期的表達(dá)干預(yù)效果不同。Pgenesil-eng2和Pgenesil-eng3可明顯抑制CNV模型在2wk時(shí)CD105mRNA的表達(dá)，抑制效率分別為78±5％，(P<0.01)；52±3％

11、，(P<0.05)。其他組的CD10.RNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化。Pgenesil-eng2具有較強(qiáng)的基因沉默效果。 4.FFA顯示光凝后第14d時(shí)，對(duì)照組的熒光滲漏率為63.2％，實(shí)驗(yàn)組為24.6％。實(shí)驗(yàn)組的BN大鼠眼底滲漏點(diǎn)數(shù)較對(duì)照組少，滲漏強(qiáng)度較弱。兩組間比較右顯著性差異。脈絡(luò)膜鋪片結(jié)果顯示：2wk時(shí)對(duì)照組大鼠的CNV面積為(31.22±1.46)103μm2，實(shí)驗(yàn)組大鼠的CNV滲漏面積為(14.46±0.82)103μm2

12、，兩組間比較右顯著性差異。 RT-PCR結(jié)果顯示：光凝后7d，VEGF mRNA的表達(dá)處于高峰，2wk后表達(dá)開(kāi)始下降，4wk明顯減弱。實(shí)驗(yàn)組VEGF mRNA的表達(dá)變化規(guī)律與對(duì)照組相似，單各個(gè)時(shí)間的表達(dá)量較對(duì)照組均明顯下降，其中2wk時(shí)實(shí)驗(yàn)組約為對(duì)照組的36.7％。對(duì)照組BN大鼠眼球在轉(zhuǎn)染后第1wk CD10.mRNA表達(dá)開(kāi)始升高，第2、3wk表達(dá)強(qiáng)度更強(qiáng)，到第4wk其視網(wǎng)膜組織中CD105mRNA表達(dá)水平開(kāi)始降低。實(shí)驗(yàn)組CD

13、105mRNA表達(dá)的變化趨勢(shì)與對(duì)照組一致，但各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的表達(dá)水平明顯降低。其中第2wk實(shí)驗(yàn)組約為對(duì)照組的21.68％。 結(jié)論： 1.半導(dǎo)體激光光凝視網(wǎng)膜可以成功地建立BN大鼠CNV模型，成模時(shí)間短，成模率高，效果可靠。 2.CD105基因的表達(dá)規(guī)律與CNV的形成過(guò)程一致，CD105基因是CNV的重要分子標(biāo)志。 3.在陽(yáng)離子脂質(zhì)體輔助下，Pgenesil-1質(zhì)?？梢猿晒Φ貙⒛康幕蜣D(zhuǎn)染至大鼠視網(wǎng)膜各層次，