CFB-siRNA抑制大鼠脈絡膜新生血管生成的實驗研究.pdf

1、目的：脈絡膜新生血管(CNV)是年齡相關性黃斑變性等眼底疾病造成患者視力嚴重受損的主要原因之一，其治療較為困難，深入研究CNV的發(fā)病機制和提供新的治療方法成為目前眼科的研究熱點。目前臨床上常用的治療方法對于控制疾病的發(fā)展具有一定的作用。但是所有的治療方法主要是針對已生成的CNV，尚不能從根本上防止CNV的發(fā)生、發(fā)展和復發(fā)。其發(fā)生機制目前尚未完全闡明，通常認為，CNV的生成與RPE-Bruch膜-脈絡膜毛細血管復合體的改變有關。它的生成和

2、發(fā)展是一個多細胞參與、多因子調控的復雜過程，炎癥介質及補體系統在CNV生成中起到一定的作用。本研究采用RNA干擾(RNAi)技術，使用前期研究中成功構建的CFB-siRNA將CFB沉默，從而阻斷旁路途徑，觀察CFB-siRNA對激光誘導的大鼠CNV及其相關生長因子VEGF、TGF-β2的抑制作用，為從根本上治愈CNV提供可能性。
　　 方法：
　　 1、不同濃度CFB-siRNA體內轉染效果評價
　　 1.18-

3、10周健康棕色挪威（BN）大鼠60只，隨機分為4組，每組15只。氪激光(波長647nm，光斑直徑200μm，功率260mW,曝光時間0.05s)圍繞視盤均勻光凝9-10個點，以見到有氣泡產生提示Bruch膜被擊穿為準建立大鼠CNV模型。
　　 1.2隨機分為實驗對照組（尾靜脈生理鹽水注射），低劑量組(25μgB因子siRNA)，中劑量組(50μgB因子siRNA)，高劑量組（75μgB因子siRNA）。實驗對照組和治療組均給予激

4、光光凝建立大鼠CNV模型。治療組通過尾靜脈注射給藥。注射時間：B因子表達高峰的前日即第2天；注射方式：尾靜脈注射，隔天注射一次，共注射三次，觀察時間為激光后3、7、14、21、28d。
　　 1.3各組大鼠分別于光凝后第3、7、14、21、28d進行熒光素眼底血管造影(FFA)。
　　 1.4造影后處死大鼠，摘除眼球取眼后段組織制作石蠟切片。選取有明確血管化的激光斑處做切片，常規(guī)HE染色。
　　 1.5隨機選取光

5、凝后第3、7、14、21、28d切片，免疫組織化學方法觀察VEGF、FactorⅧ表達情況。
　　 1.6圖像分析與統計學處理采用SPSS16.0軟件對所得數據各時間點灰度值進行分析，觀察其隨濃度變化的抑制效應。
　　 2、觀察激光后大鼠CFB與CNV生成有關的VEGF、TGF-β2的表達關系
　　 2.1隨機選取實驗對照組與高劑量組（75μgB因子siRNA），部分組織標本來源于第一部分。
　　 2.2

6、分別于7、14、21、28d行B因子、VEGF、TGF-β2免疫組化及反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)觀察CFB與VEGF、TGF-β的表達強度關系。
　　 2.3采用SPSS16.0軟件對所得數據進行統計學分析。
　　 3、觀察CFB-siRNA對視網膜的毒性作用
　　 3.1隨機選取實驗對照組與高劑量組（75μgB因子siRNA），組織標本來源于第一部分。并增設空白對照組。
　　 3.2分別于7、

7、14、21、28d處死大鼠，摘除眼球取眼后段組織制作石蠟切片。選取遠離激光斑點處組織做切片，常規(guī)HE染色及透射電鏡觀察。
　　 結果：
　　 1、不同濃度CFB-siRNA體內轉染效果評價
　　 1.1試驗對照組光凝后7d出現CNV,14d逐漸增多，21d達高峰。
　　 1.2 FFA表現為造影早期強熒光斑，晚期出現與視網膜血管無關的熒光素滲漏。
　　 1.3試驗治療組大鼠眼光凝后21dCNV發(fā)生

8、率到達高峰，但較對照組明顯降低，各組FFA進行比較，高劑量治療組CNV發(fā)生率明顯低于低劑量治療組。
　　 1.4光鏡可見到CNV自脈絡膜穿過破裂的Bruch膜突向視網膜下，以及巨噬細胞浸潤、RPE細胞遷移增生和纖維母細胞增多等。
　　 1.5免疫組織化學染色結果顯示VEGF、FactorⅧ表達較對照組均減弱，且高劑量治療組減弱程度高于低劑量治療組。
　　 2、觀察光凝后大鼠CFB與CNV生成有關的VEGF、TGF

9、-β2的表達關系
　　 2.1免疫組化結果顯示：實驗對照組CFB提前于VEGF、TGF-β2出現，7d后表達減少，光凝后14天仍有少量表達。VEGF、TGF-β2表達高峰均落后于CFB表達高峰，前兩者在光凝后14-21d出現明顯表達增多，之后略有下降。與對照組相比，實驗治療組的CFB在7d時表達減少，其后逐漸接近對照組，VEGF與TGF-β2表達均顯著降低。
　　 2.2 RT-PCR結果顯示：在實驗對照組中，CFB表達

10、持續(xù)增加，VEGF、TGF-β2呈曲線變化，在21 d表達高峰；在實驗治療組中，CFB、VEGF、TGF-β2表達顯著減少，且各時間點無顯著變化。
　　 3、觀察CFB-siRNA對視網膜的毒性作用
　　 各組HE染色后觀察遠離激光斑點處組織視網膜各層結構清晰，排列規(guī)則，無明顯異常。透射電鏡檢查結果顯示：視桿、視錐細胞完好，但膜盤結構輕度紊亂，間隙稍不規(guī)則。神經節(jié)細胞層細胞間輕度水腫，神經纖維層輕度水腫，線粒體結構清晰，