CFB-siRNA抑制大鼠脈絡(luò)膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)是由多種病因引起的眼底疾病,嚴(yán)重影響患者視力。傳統(tǒng)治療方法作用機(jī)制均為消除已存在的異常血管,并未改變導(dǎo)致CNV形成的病理基礎(chǔ),因此不能阻止其復(fù)發(fā)。在CNV的多種發(fā)病機(jī)制中,補(bǔ)體的作用機(jī)制逐漸引起人們的重視,眼部的炎癥反應(yīng)和免疫活化在CNV的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。補(bǔ)體活化過(guò)程中產(chǎn)生的活性片段具有炎癥介質(zhì)作用,其存在可能誘導(dǎo)CNV的生成。有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)

2、體通過(guò)旁路途徑激活,在眼后段導(dǎo)致了膜攻擊復(fù)合物(membrance attack complex,MAC)在RPE和/或脈絡(luò)膜的形成和沉積,隨之誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)因子釋放,導(dǎo)致膜滲透性的暫時(shí)改變,釋放的血管生長(zhǎng)因子促進(jìn)脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖,導(dǎo)致了CNV的發(fā)生。因此,補(bǔ)體活化的旁路途徑可能是激光誘導(dǎo)大鼠CNV生成的根本原因,而B(niǎo)因子(complement factor B,CFB)作為補(bǔ)體旁路途徑的重要因子可以成為我們阻斷的靶點(diǎn)。本文采用激

3、光誘導(dǎo)大鼠CNV模型,觀察CNV中CFB、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞因子(basic fibroblast growth factor,BFGF)的變化規(guī)律,采用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù),使用前期研究中成功構(gòu)建的CFB-siRNA將CFB沉默,阻斷補(bǔ)體旁路途徑,觀察CFB-siRNA對(duì)CFB及血管生長(zhǎng)因子VEGF、

4、BFGF的抑制作用,為CNV的治療開(kāi)辟新的思路。
　　 方法:
　　 1實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管中CFB、VEGF和BFGF的表達(dá)
　　 1.18-10周健康棕色挪威(Brown Norway,BN)大鼠25只,隨機(jī)分為5組,每組5只。氪激光(波長(zhǎng)647nm,光斑直徑200μm,功率260mW,曝光時(shí)間O.05s)圍繞視盤(pán)均勻光凝9-10個(gè)點(diǎn),以見(jiàn)到有氣泡產(chǎn)生提示Bruch膜被擊穿為準(zhǔn)建立大鼠CNV模型。
　　

5、 1.2分別于光凝后第3、7、14、21、28d進(jìn)行熒光素眼底血管造影(fluoresceinfundus angiography,FFA),并計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)CNV發(fā)生率。
　　 1.3造影后處死大鼠,摘除眼球取眼后段組織制作石蠟切片。選取有明確血管化的激光斑處做切片,常規(guī)HE染色。
　　 1.4隨機(jī)選取光凝后第3、7、14、21、28d切片,進(jìn)行CFB、VEGF和BFGF免疫組化染色,并測(cè)定其灰度值。確定CFB的表達(dá)高

6、峰時(shí)間點(diǎn),為下步注藥時(shí)間選取標(biāo)準(zhǔn)。
　　 1.5圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)各時(shí)間點(diǎn)灰度值進(jìn)行分析,觀察各因子表達(dá)規(guī)律。繪制不同時(shí)間點(diǎn)CFB表達(dá)線圖,觀察CFB表達(dá)高峰時(shí)間。
　　 2 CFB-siRNA抑制BN大鼠脈絡(luò)膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究
　　 2.1 BN大鼠36只,隨機(jī)分為3組,每組12只?？瞻讓?duì)照組不做處理,實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)治療組均給予激光光凝建立大鼠CNV模型。

7、實(shí)驗(yàn)治療組在B因子表達(dá)高峰前日,尾靜脈注射CFB-SiRNA50mg,隔天注射一次,共注射三次。觀察時(shí)間為光凝后3、7、14、21、28d。
　　 2.2各組大鼠分別于光凝后第3、7、14、21、28d進(jìn)行FFA。
　　 2.3造影后6h待其體內(nèi)熒光素染料大部分被排出后,處死大鼠,摘除眼球取眼后段組織制作石蠟切片。選取有明確血管化的激光斑處做切片,常規(guī)HE染色。
　　 2.4各組均進(jìn)行CFB、VEGF和BFGF免

8、疫組化染色,并測(cè)定其灰度值。
　　 2.5圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS16.0軟件對(duì)各組灰度值進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn),當(dāng)符合方差齊性和正態(tài)性分布時(shí),采用單因素方差分析,組間均數(shù)的比較用SNK-q檢驗(yàn)。不符合正態(tài)性分布或方差不齊時(shí),采用秩和檢驗(yàn),兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn),方差不齊時(shí)用近似t檢驗(yàn)。對(duì)光凝后CNV發(fā)生率進(jìn)行x2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)

9、膜新生血管中CFB、VEGF和BFGF的表達(dá)
　　 1.1 CNV在FFA中表現(xiàn)為早期強(qiáng)熒光斑,晚期出現(xiàn)與視網(wǎng)膜血管無(wú)關(guān)的熒光素滲漏。CNV發(fā)生率隨著時(shí)間變化逐漸增多,在光凝后21d達(dá)高峰,之后略有下降。
　　 1.2光鏡可見(jiàn)到CNV自脈絡(luò)膜穿過(guò)破裂的Bruch膜突向視網(wǎng)膜下,同時(shí)伴有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、RPE細(xì)胞遷移增生和纖維母細(xì)胞增多等。
　　 1.3 CFB在光凝后3天達(dá)最高峰,隨后表達(dá)減少,光凝后7天仍有少量表

10、達(dá),光凝后2-4周表達(dá)趨于穩(wěn)定。
　　 1.4 VEGF和BFGF在光凝后7-14d表達(dá)明顯增多,在光凝后21d達(dá)高峰,之后略有下降。
　　 2 CFB-SiRNA抑制BN大鼠脈絡(luò)膜新生血管的研究
　　 2.1實(shí)驗(yàn)治療組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組FFA進(jìn)行比較,在光凝后14d、21d、28d兩組CNV發(fā)生率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.2免疫組化結(jié)果顯示:三因子各組數(shù)據(jù)均符合方差齊性和正態(tài)性分布,故采用

11、單因素方差分析,組間均數(shù)的比較用SNK-q檢驗(yàn)?？瞻讓?duì)照組正常大鼠CFB、VEGF和BFGF在視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中的表達(dá)非常弱。在光凝后7d、14d、21d、28d,實(shí)驗(yàn)治療組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組CFB灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。光凝后14d、21d、28d,實(shí)驗(yàn)治療組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組VEGF和BFGF灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,實(shí)驗(yàn)治療組表達(dá)水平受到抑制。
　　 結(jié)論:
　　 1補(bǔ)體激活旁路途徑在CNV生成中扮演重要角色,光凝誘導(dǎo)CNV中補(bǔ)體