牛Gtl2基因的克隆及Dlk1-Gtl2印記區(qū)域在體細(xì)胞核移植牛中的DNA甲基化狀態(tài)分析.pdf

1、體細(xì)胞核移植技術(shù)在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)等諸多領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。盡管體細(xì)胞核移植已經(jīng)在多種哺乳動(dòng)物中獲得成功,但仍有大多數(shù)克隆動(dòng)物在孕期流產(chǎn),只有少數(shù)能發(fā)育到妊娠末期或成年,即使是存活下來(lái)的克隆動(dòng)物也多伴有器官發(fā)育異常,這些制約了體細(xì)胞核移植技術(shù)的廣泛應(yīng)用。在體細(xì)胞核移植過(guò)程中,體細(xì)胞核放棄已有的高度分化的體細(xì)胞模式,進(jìn)行重編程形成全能性的胚胎模式,此過(guò)程稱(chēng)為表觀重編程。目前認(rèn)為,供體核的不完全重編程導(dǎo)致在發(fā)育過(guò)程中有重要作用的基因異常

2、表達(dá)或沒(méi)有表達(dá)是克隆效率低下的主要因?yàn)?。DNA甲基化是基因組主要的表觀修飾模式,是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段,DNA甲基化的程度對(duì)基因的表達(dá)有重要的調(diào)控作用。
　　 基因組印記是指來(lái)自雙親的等位基因的差異性表達(dá),即來(lái)自親本的等位基因或染色體在發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生專(zhuān)一性的加工修飾,導(dǎo)致后代細(xì)胞中兩個(gè)親本來(lái)源的等位基因有不同的表達(dá)活性,具有這種現(xiàn)象的基因稱(chēng)為印記基因。Dlk1-Gtl2印記區(qū)域的印記基因參與胚胎和胎盤(pán)的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控,該印記區(qū)

3、域在各個(gè)物種中高度保守。目前,Dlk1-Gtl2印記區(qū)域在人和鼠中研究的比較多,由于基因序列的限制,該區(qū)域在牛中研究的很少。
　　 為了研究Dlk1-Gtl2印記區(qū)域在體細(xì)胞核移植牛中的DNA甲基化狀態(tài),首先采用RACE方法得到了牛Gtl2基因的全序列,結(jié)果顯示牛Gtl2基因存在可變剪切,并且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與Kozak規(guī)則相匹配的翻譯起始序列,推測(cè)其可能是一種非編碼的RNA。根據(jù)NCBI上已知的牛Dlk1和已獲得的牛Gtl2 cDNA

4、序列,應(yīng)用NCBI／Blast程序進(jìn)行序列比對(duì),確定了Dlk1-Gtl2印記區(qū)域在牛21號(hào)染色體上的位置以及Gtl2 DMR和IG-DMR區(qū)域。
　　 亞硫酸氫鹽測(cè)序法是一種可靠性及精確度很高的方法,能明確目的片段中每一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。為了探求核移植過(guò)程中DNA甲基化的表觀重編程是否充分,本試驗(yàn)利用亞硫酸氫鹽測(cè)序法分析了Gtl2 DMR、IG—DMR和Dlk15'啟動(dòng)子在出生48h內(nèi)死亡的克隆牛和自然繁殖牛肺臟中的DN

5、A甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示,Gtl2 DMR甲基化程度在克隆牛和自然繁殖牛肺臟中都較高,且沒(méi)有顯著差異；體細(xì)胞核移植牛中IG-DMR甲基化程度較低,與正常對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；而Dlk15'啟動(dòng)子區(qū)在體細(xì)胞核移植牛表現(xiàn)出高甲基化,與正常對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。由此可見(jiàn),IG-DMR和Dlk15'啟動(dòng)子在體細(xì)胞核移植牛肺臟中出現(xiàn)了甲基化重編程紊亂,這種異常甲基化可能造成印記錯(cuò)誤從而影響個(gè)體器官的正常發(fā)育,可能是導(dǎo)致克