蛋白質組學分析重組腺病毒介導hSSTR2基因轉染對胰腺癌細胞蛋白表達的影響及Lv-VIM-shRNA的構建和鑒定.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：蛋白質組學分析腺病毒介導hSSTR2基因轉染對胰腺癌細胞蛋白表達的影響
　　 目的：探討Hsstr2基因轉染對胰腺癌細胞Panc-1蛋白表達的影響；尋找新的胰腺癌敏感治療靶點。
　　 方法：利用腺病毒載體Ad.CMV.Egfp.Hsstr2.將Hsstr2全長Cdna導入胰腺癌細胞Panc-1，用RT-PCR及Western Blot分別檢測Hsstr2在Mrna水平及蛋白水平

2、上的表達。采用熒光差異蛋白組學（2D-DIGE）技術分離并篩選轉染Hsstr2的實驗組、空載體對照組以及空白組胰腺癌細胞之間差異表達蛋白；用反射式基質輔助激光解吸附電離串聯(lián)飛行時間質譜（MALDI—TOF/TOF)技術對差異蛋白進行鑒定。采用Western Blot驗證波形蛋白、PKM2、SEPT11的差異表達；采用免疫組化檢測上述三種蛋白在胰腺癌組織中的表達。
　　 結果：Hsstr2成功的轉染了胰腺癌細胞，建立了Hsstr2

3、陰性和陽性表達胰腺癌細胞Panc-1熒光差異蛋白表達圖譜。經(jīng)DeCyder v6.5軟件分析，共得到21個有統(tǒng)計學意義的差異蛋白質點；選擇1.3倍以上的差異點18個，經(jīng)質譜鑒定得到13個蛋白質，在轉染Hsstr2的胰腺癌細胞中低表達蛋白為GMP合酶、磷酸化應激誘導蛋白、谷氨酸脫氫酶、Septin-11、波形蛋白、異檸檬酸脫氫酶α亞基、線粒體內膜易位酶；高表達蛋白為真核延長因子1α1、丙酮酸激酶異構體M2型、烯酰-CoA水合酶、轉錄調節(jié)因

4、子1-β、Mitofilin、HSP105。
　　 結論：實驗篩選的差異蛋白功能涉及到糖、脂肪以及核酸代謝,細胞生長調節(jié)和細胞凋亡等過程。對這些蛋白質功能的進一步驗證，將有助于解析缺失Hsstr2基因表達胰腺癌細胞生長、侵襲轉移的分子機制，從而為尋找新的胰腺癌敏感治療靶點奠定基礎。
　　 第二部分：Lv-VIM-shRNA的構建和鑒定
　　 目的：構建人VIM基因RNA干擾(RNAi)慢病毒表達載體,并評價其在胰

5、腺癌細胞中的干擾效果。
　　 方法：利用在線軟件設計3條人VIM基因shRNA序列，并選用一條文獻報道序列，合成、退火形成雙鏈寡核酸后克隆到Pgcl-GFP/U6 載體的黏性末端，將連接產(chǎn)物轉化到DH5α感受態(tài)細胞,經(jīng)PCR篩選陽性克隆、測序鑒定。實時定量PCR和Western Blot用于在轉染了過表達質粒Pegfp-N1-Hvim的293T細胞中篩選有效的Pgcl-GFP/U6-shRNA,將其和pHelper1.0、pHe

6、lper2.0共轉染293T細胞,包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒并測定病毒滴度。Real-time PCR和Western Blot在胰腺癌細胞Panc-1中驗證慢病毒(Lv-VIM-shRNA)干擾Vim Mrna和波形蛋白表達效果。
　　 結果：成功構建攜帶VIM基因干擾序列的慢病毒表達載體，病毒滴度為2×109TU/ml。在胰腺癌細胞Panc-1中驗證其干擾VIM基因效果，Vim Mrna和Vimentin表達明顯下調。