胰腺癌細(xì)胞株耐藥蛋白質(zhì)組學(xué)研究：熱休克蛋白對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、胰腺癌是一種極具侵襲性的癌癥類型,是因癌癥死亡的主要原因之一,世界范圍內(nèi)僅2000年就有超過(guò)200,000人死于此疾病。胰腺癌有其特征性的基因類型,常發(fā)生K-ras、p53、p16INK4α及Smad 4的基因突變。胰腺癌的高致死率是因其對(duì)化療和放射治療不敏感,因此需要研究與探索新的治療方法。免疫監(jiān)督抑制腫瘤發(fā)生時(shí),腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)正常表達(dá)于自然殺傷細(xì)胞,因此是一種天然的腫瘤殺傷因子。已有許多證據(jù)表明,可將TR

2、AIL用于人類胰腺癌的治療：①胰腺癌細(xì)胞表面表達(dá)TRAIL死亡受體DR4、DR5;②重組可溶性TRAIL可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡；③給胰腺癌移植瘤小鼠注射表達(dá)TRAIL的腺病毒載體可抑制腫瘤生長(zhǎng)；④TRAIL聯(lián)合用藥可抑制胰腺癌病人的腫瘤生長(zhǎng)。然而大多數(shù)胰腺癌細(xì)胞卻對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的作用并不敏感,其原因就是胰腺癌細(xì)胞存在抵抗TRAIL介導(dǎo)凋亡的機(jī)制。 信號(hào)通路中TRAIL誘導(dǎo)的凋亡由多水平調(diào)節(jié),故TRAIL在進(jìn)入胰腺癌臨床試

3、驗(yàn)前需闡明其抵抗機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)上的研究方法可以定量研究復(fù)雜的細(xì)胞蛋白質(zhì)圖譜變化以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用,可監(jiān)控不同生理?xiàng)l件下的分子變化過(guò)程。本論文采用細(xì)胞與分子生物學(xué)和蛋白組學(xué)方法研究差異表達(dá)蛋白,并進(jìn)一步通過(guò)免疫共沉淀分析差異蛋白的相互作用及其在p53蛋白功能調(diào)節(jié)中的作用。我們的研究結(jié)果首次闡明HSP27與HSPA8可通過(guò)與p53蛋白相互作用來(lái)調(diào)節(jié)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡,揭示了一種新的胰腺癌細(xì)胞耐藥機(jī)制。 第一部分

4、 TRAIL對(duì)胰腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡作用以及胰腺癌細(xì)胞TRAIL受體的表達(dá) 采用MTT法測(cè)定TRAIL對(duì)胰腺癌細(xì)胞株SW1990和PANC1的增殖抑制,通過(guò)倍比梯度稀釋,計(jì)算兩種細(xì)胞在不同藥物濃度作用下的增殖抑制率,以此來(lái)鑒定腫瘤細(xì)胞株對(duì)TRAIL的敏感性。通過(guò)AnnexinV-FITC雙染法研究TRAIL處理后兩種胰腺癌細(xì)胞株的凋亡發(fā)生率。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR法(RT-PCR)分析2種細(xì)胞株中TRAIL受體(DR4,DR5,DcR1

5、及DcR2)在mRNA水平的表達(dá)情況,了解受體表達(dá)量的高低是否與其對(duì)藥物的敏感性相關(guān)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):TRAIL,對(duì)SW1990細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用(IC50=0.074μg/ml),且該作用呈劑量依賴性,而對(duì)PANC1細(xì)胞的作用則不明顯(IC50=0.65μg/ml);在相同的藥物濃度下,流式細(xì)胞檢測(cè)兩種細(xì)胞的凋亡率有顯著的差異,該結(jié)果與細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)相一致,證明TRAIL以誘導(dǎo)凋亡的方式使細(xì)胞死亡；RT-PCR顯示,TRAIL受

6、體mRNA的表達(dá)與其敏感性無(wú)直接關(guān)聯(lián),提示胰腺癌細(xì)胞對(duì)于TRAIL的抵抗更依賴于胞內(nèi)機(jī)制的調(diào)節(jié)。 第二部分蛋白組學(xué)技術(shù)研究TRAIL誘導(dǎo)前后細(xì)胞差異表達(dá)蛋白 依照文獻(xiàn),采用循環(huán)反復(fù)凍融法提取細(xì)胞總蛋白,Bradford法蛋白定量。雙向電泳分離藥物作用前后細(xì)胞總蛋白,獲得分辨率高、重復(fù)性好的雙向電泳譜圖譜。敏感株SW1990與耐藥株P(guān)ANC1的pH 3-10的圖譜顯示平均蛋白點(diǎn)分別為620±15和550±23。PDQues

7、t 7.4軟件圖像分析比對(duì),以兩倍差異為閾值得到差異蛋白點(diǎn)58個(gè),質(zhì)譜成功鑒定38個(gè)。功能預(yù)測(cè)顯示與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)氧化還原、分子伴侶等相關(guān)。兩種細(xì)胞存在8個(gè)共同差異蛋白,值得關(guān)注的是HSP27和HSPA8,它們?cè)趦煞N細(xì)胞中的差異截然相反,如SW1990表現(xiàn)為游離態(tài)的HSP27低表達(dá),而游離態(tài)的HSPA8高表達(dá)；PANC1呈完全相反的現(xiàn)象。推測(cè)兩者可能參與TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)過(guò)程,具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

8、 第三部分質(zhì)譜結(jié)果驗(yàn)證及差異蛋白相互作用的功能研究 采用western-blot在蛋白水平、半定量RT-PCR在mRNA水平進(jìn)行質(zhì)譜結(jié)果的驗(yàn)證。結(jié)果顯示HSP27和HSPA8在敏感株和耐藥株中的表達(dá)差異與雙向電泳結(jié)果一致,證明質(zhì)譜結(jié)果可信。借助信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究工具PathwayAssist 3.08建立了生物分子相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò),研究發(fā)現(xiàn)HSP27、HSPA8可分別與p53蛋白結(jié)合并發(fā)生相互作用,進(jìn)而調(diào)節(jié)p53下游相關(guān)基因(B

9、AX/Bcl-2、FAS/APO1及IGF-BP3等)的表達(dá),從而調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程。該部分利用免疫共沉淀(IP)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),p53可同時(shí)與HSP27和HSPA8結(jié)合形成三重復(fù)合物,且藥物誘導(dǎo)后兩種蛋白與p53的親和力發(fā)生改變,SW1990表現(xiàn)為HSP27與p53的親和力增加,而HSPA8與之的親和力下降；PANC1呈完全相反的現(xiàn)象。該結(jié)果揭示,在TRAIL誘導(dǎo)的凋亡中,HSP27可能為一種正性調(diào)控因子,而HSPA8可能為一種負(fù)性調(diào)控因