mTOR抑制劑Rapamycin抗Hela細(xì)胞雙向電泳差異性分析.pdf

1、背景：雷帕霉素(Rapamycin；Sirolimus；西羅莫司)最初從一種土壤細(xì)菌中分離得到，是mTOR的特異性抑制劑，有較強(qiáng)的抑制免疫和抗真菌作用。由于雷帕霉素的這種作用只針對(duì)部分腫瘤細(xì)胞，且必須依賴其他藥物才能使腫瘤逆轉(zhuǎn)，因而對(duì)mTOR復(fù)合物信號(hào)通路在體內(nèi)發(fā)揮功能的具體機(jī)制及mTOR的底物存在諸多爭(zhēng)議。 本實(shí)驗(yàn)首先采用MTT比色法，觀察雷帕霉素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的抑制作用，并計(jì)算出48h時(shí)的半數(shù)抑制濃度IC50。進(jìn)

2、一步運(yùn)用雙向電泳的方法，比較雷帕霉素作用前后細(xì)胞蛋白表達(dá)的變化，從而篩選出與mTOR活性變化相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)。從而為進(jìn)一步研究mTOR抑制劑雷帕霉素抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制開辟一條新的途徑。 實(shí)驗(yàn)方法：1.細(xì)胞培養(yǎng)及雷帕霉素半抑制濃度IC50的測(cè)定以含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細(xì)胞，按MTT法，酶標(biāo)儀490nm處測(cè)得各組吸光度，計(jì)算雷帕霉素對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率。以抑制率為縱坐標(biāo)，藥物濃度為橫坐標(biāo)，繪制

3、48小時(shí)生長(zhǎng)抑制曲線，運(yùn)用改良的寇氏法計(jì)算出IC50。 2.以固相pH梯度等電聚焦(IEF)為第一向的雙向電泳分別以相同條件培養(yǎng)雷帕霉素處理過與未處理的Hela細(xì)胞，提取處理組與-1-未處理組的總蛋白并測(cè)定濃度。兩步電泳后，運(yùn)用Umax掃描儀及Labscan軟件獲得凝膠圖像。使用ImageMasterTM2DplatinumSoftware5.0對(duì)圖像進(jìn)行校正、點(diǎn)檢測(cè)分析、背景消減、校正和量化。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)的

4、分析在SPSS13.0軟件和EXCEL上進(jìn)行，采用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，顯著性水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果：1.雷帕霉素對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用隨著濃度和時(shí)間的變化而變化。濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)都能夠使雷帕霉素對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率增加。通過運(yùn)用改良的寇氏法計(jì)算出48小時(shí)雷帕霉素對(duì)Hela細(xì)胞的半抑制濃度IC50為38.924nM。小劑量的雷帕霉素能夠有效抑制Hela細(xì)胞的增殖。 2.通過對(duì)電泳和上樣條件的優(yōu)化，獲

5、得了圖像清晰，分辨率高和重復(fù)性好的雙向電泳凝膠圖譜。在相同的條件下，對(duì)處理組與未處理組細(xì)胞分別進(jìn)行了三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用圖像分析軟件分析后發(fā)現(xiàn)，處理組獲得的可分辨蛋白膠點(diǎn)數(shù)為1256±37，未處理組為1312±25。對(duì)處理組與未處理組的三塊膠進(jìn)行匹配，其匹配率分別為89.5％和92.3％。膠點(diǎn)位置的重復(fù)性按Corbett等報(bào)道的方法進(jìn)行，任意選擇各組三塊膠中相互匹配和分辨清晰的50個(gè)蛋白膠點(diǎn)，選取位置居中的一個(gè)蛋白為原點(diǎn)，測(cè)出其他兩塊膠對(duì)

6、應(yīng)點(diǎn)在第一向IEF和第二向SDS-PAGE上的偏差，發(fā)現(xiàn)三塊膠在位置上有較好的重復(fù)性。其中處理組第一向IEF偏差為1.07±0.12mm，第二向SDS-PAGE偏差為1.22±0.35mm，未處理組第一向偏差為0.89±0.23mm，第二向偏差為1.02±0.26mm。 3.在相同條件下，分別對(duì)處理組與未處理組進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，處理組與未處理組的蛋白分布大致相同。多集中于PI4.0～8.2，MW20.2kD～70.0kD之間。處