肺癌與炎癥性胸腔積液蛋白質(zhì)熒光差異雙向電泳圖譜分析.pdf

1、肺癌近年來已經(jīng)成為發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一。肺癌的臨床預(yù)后很差，由于缺乏敏感而準(zhǔn)確的篩查方法，其五年生存率僅為15％。所以通過患者的體液如血液、胸腔積液等尋找高特異性、高敏感性的腫瘤標(biāo)志物具有重大意義。與血液中蛋白質(zhì)來源紛雜不同，胸腔積液通常是由肺部病變直接產(chǎn)生，其中可能包含腫瘤特異的分泌蛋白，因而是篩選高敏感性和特異性的肺部腫瘤相關(guān)標(biāo)志物的合適載體。分析胸腔積液中分泌蛋白的組成還有助于進(jìn)一步探討肺部疾病發(fā)生發(fā)展的分子機理。目前，以

2、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為代表的高通量篩查手段的興起為尋找腫瘤標(biāo)志物提供了新的契機。利用凝膠分離結(jié)合質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究肺癌的滲出性胸腔積液的蛋白質(zhì)組成，首先需要去除其中的高豐度蛋白，從而減少其對低豐度蛋白的遮蔽效應(yīng)，提高分離技術(shù)的敏感性。同時，有必要采用非腫瘤性肺部炎癥性疾病的胸腔積液作為對照研究，用以消除常規(guī)炎癥免疫反應(yīng)對于篩選腫瘤特異性分泌蛋白的影響。所以，本研究在建立胸腔積液高豐度蛋白去除的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上，選取肺(腺)癌患者胸腔

3、積液為主要研究對象，以肺炎和結(jié)核的胸腔積液標(biāo)本作為對照，結(jié)合熒光差異雙向凝膠電泳分離技術(shù)(2D—DIGE)，分析肺腺癌與肺部良性炎癥病變胸腔積液之間蛋白表達(dá)譜的差異，為進(jìn)一步質(zhì)譜鑒定潛在腫瘤特異相關(guān)的差異蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能建立研究平臺。 研究方法和主要結(jié)果： 首先對3例肺(腺)癌患者及2例結(jié)核患者的胸腔積液進(jìn)行了初步分析，采用傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳分離和銀染方法來檢驗樣品制備的質(zhì)量，并比較了高豐度蛋白去除(白蛋白去除試劑盒，

4、Sigma公司)的效果。結(jié)果顯示，去除高豐度白蛋白后增加了778個蛋白點，檢出率提高80％，成功建立了胸腔積液高豐度蛋白去除的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺。在對5例胸腔積液進(jìn)行初步差異分析后，進(jìn)一步對部分差異蛋白進(jìn)行了MALDI—TOF—MS質(zhì)譜鑒定，其中一個蛋白點被鑒定為14-3-3蛋白家族的成員“14-3-3ζ’，且結(jié)果被 Western blot證明。這是首次發(fā)現(xiàn)該蛋白可以作為分泌蛋白出現(xiàn)在胸腔積液中。 在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)而選取10

5、名肺(腺)癌患者，6名結(jié)核性胸膜炎患者及4名肺炎患者的胸腔積液標(biāo)本，采用了準(zhǔn)確性更高的熒光差異雙向凝膠電泳技術(shù)(2D—DIGE)對3類疾病的差異蛋白圖譜進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：肺腺癌組和結(jié)核組比共找到10個差異點；肺腺癌組和肺炎組比共找到34個差異點；結(jié)核組和肺炎組比共找到16個差異點。3類疾病間共找到差異點為41個。其中，肺腺癌組和肺良性炎癥疾病組(結(jié)核與肺炎)胸腔積液之間共找到6個存在的差異表達(dá)蛋白點，其中4個在肺腺癌組中表達(dá)水平均上調(diào)

6、，2個在肺腺癌胸腔積液中表達(dá)水平均下調(diào)，且改變幅度比較接近。 主要結(jié)論： 1)建立去除胸腔積液中主要高豐度蛋白(白蛋白)的分析平臺后，比傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳分離和銀染方法可多檢測80％的蛋白點。說明去除高豐度蛋白可有效提高低豐度蛋白的檢出率。 2)首次發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白家族成員“14-3-3ζ’可出現(xiàn)在胸腔積液中，其結(jié)果被Western blot證明．進(jìn)一步說明，去除高豐度蛋白對于胸腔積液差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究非常重