合肥市部分醫(yī)院產(chǎn)CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的耐藥性分析及其分子生物學(xué)特征.pdf

1、目的 了解產(chǎn)CTX—M型酶的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對(duì)14種抗菌素的耐藥性，以指導(dǎo)臨床用藥。 了解合肥市部分醫(yī)院CTX-M酶的基因型，研究新的CTX-M酶的生化及耐藥特性。 材料與方法 菌株來(lái)源： 1999年至2000年收集的合肥市四家大型醫(yī)院的臨床產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，共98株。 方法 以98株ESBLs+菌株總DNA為模板，使用blacTX-M通用引物進(jìn)行PCR

2、擴(kuò)增以篩選出CTX-M+菌株；再將CTX-M+菌株與E．coliC600共9呼，行轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)：采用瓊脂平皿稀釋法對(duì)野生株與接合子進(jìn)行MIC測(cè)定。 根據(jù)通用引物擴(kuò)增結(jié)果，設(shè)計(jì)兩對(duì)全編碼區(qū)擴(kuò)增引物，為方便后續(xù)試驗(yàn)，5、端分別加EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)。 將全編碼區(qū)PCR產(chǎn)物，交送生物公司進(jìn)行直接序列分析，結(jié)果至Genbank進(jìn)行比對(duì)，確定CTX-M酶的基因型。 在EcoRI和BamHI酶切之后，將新基因型全編

3、碼基因克隆入表達(dá)載體pHSG398，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞EcoliDH5α，用瓊脂平皿稀釋法測(cè)定14種抗生素的MIC值。 采用超聲破碎法進(jìn)行產(chǎn)新酶細(xì)菌的接合子的粗酶提取，等電聚焦電泳測(cè)定其pI。 采用堿裂解法抽取產(chǎn)新酶的細(xì)菌的質(zhì)粒，PstI消化，進(jìn)行質(zhì)粒分析。 采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsedfieldgelelectrophoresis，PFGE)分析產(chǎn)新酶細(xì)菌的同源性。 結(jié)果 24株大腸埃希菌和3

4、0株肺炎克雷伯菌經(jīng)通用引物PCR法被證實(shí)產(chǎn)CTX—M酶；占所有分離菌株的18．6％(54／299)，占產(chǎn)ESBLs菌株的55．1％(54／98)；共22株大腸埃希菌和30株肺炎克雷伯菌轉(zhuǎn)移接合成功；野生株的MIC結(jié)果顯示對(duì)哌拉西林、頭孢呋辛、頭孢噻肟和頭孢曲松鈉的耐藥率最高，達(dá)到100％，對(duì)亞胺培南全部敏感；轉(zhuǎn)移接合子的耐藥性較野生株有所下降，對(duì)氟喹諾酮的敏感性明顯增加。 CTX-M．1組引物的擴(kuò)增結(jié)果共有21株細(xì)菌呈陽(yáng)性；CT

5、X-M-9組引物的擴(kuò)增結(jié)果共有34株細(xì)菌呈陽(yáng)性；其中1株呈二者共同陽(yáng)性；CTX-M-2組通用引物的擴(kuò)增結(jié)果無(wú)陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)。 序列分析結(jié)果表明：21株CTX-M．1組的陽(yáng)性結(jié)果由19株表達(dá)CTX-M-3，1株表達(dá)CTX-M．12和1株新的基因型(CTX-M-3在164位發(fā)生氨基酸取代造成)組成；34株CTX-M-9組的陽(yáng)性結(jié)果由26株表達(dá)CTX-M．14和8株產(chǎn)新酶細(xì)菌(CTX-M-14在28，43，48三個(gè)位置發(fā)生氨基酸取代而導(dǎo)致5

6、種新酶的出現(xiàn))所構(gòu)成。 轉(zhuǎn)化株對(duì)抗生素的耐藥性有所下降，但依然表現(xiàn)為優(yōu)先水解頭孢噻肟鈉和頭孢曲松鈉。 產(chǎn)新型CTX-M酶細(xì)菌的轉(zhuǎn)移接合子的粗酶提取液的等電聚焦結(jié)果表明，分別在8．0，8．4，7．6，5．4等處各有陽(yáng)性顯示。 CTX-M-14來(lái)源新型酶的耐藥性質(zhì)粒圖譜分析顯示，Ec0269和Ecol82具有相似酶切圖譜，其他呈多樣性。 8株攜帶CTX-M．14來(lái)源新型酶細(xì)菌總DNA(XbaI酶切)的脈沖場(chǎng)凝

7、膠電泳的分析結(jié)果顯示，除Ec0269和Ecol82具有同源性，其他均無(wú)克隆傳播的依據(jù)。 結(jié)論 合肥市四家大型醫(yī)院中有產(chǎn)CTX-M酶的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的檢出；無(wú)論野生株或接合子均表現(xiàn)對(duì)頭孢噻肟鈉和頭孢曲松鈉高度耐藥，但是接合子的耐藥性較野生株有所下降。 本地區(qū)CTX-M酶以CTX-M-14和CTX-M-3為主，同時(shí)出現(xiàn)二者來(lái)源的多種變異型，其耐藥表型表現(xiàn)為與母系酶沒(méi)有顯著差別；各變異株均存在著多重耐藥機(jī)制；