ATRA調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞中KLF4表達的分子機制.pdf

1、目的:維生素A的衍生物全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)在多種細胞中具有調(diào)節(jié)細胞生長和誘導分化的作用。維甲酸受體(retinoicacid receptor,RAR)是一類重要的核受體,有RARα、RARβ和RARγ三種亞型。該類受體通過與其相應的配體ATRA相結(jié)合,激活或抑制多種基因的表達,從而在細胞增殖、分化及凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。Krüppel樣因子4(krüppel-like facto

2、r,GKLF/KLF4)是一類含有鋅指結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子,對血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)具有抑制增殖、誘導分化的作用。
　　 大量的實驗結(jié)果表明,在VSMC中,ATRA可以顯著誘導KLF4基因的表達,但目前ATRA誘導KLF4表達的分子機制尚不清楚。本研究探討ATRA激活KLF4基因表達的機制,研究RARα及相關的信號通路在ATRA誘導KLF4表達過程中的作用,以期明確ATRA

3、誘導VSMC分化的分子基礎。
　　 方法:用貼塊法分離、培養(yǎng)大鼠VSMC,胰蛋白酶消化傳代,取3～5代細胞進行實驗。Western blot分析檢測ATRA對KLF4和RARα表達的影響,應用不同信號通路抑制劑研究介導KLF4表達的信號轉(zhuǎn)導途徑。
　　 結(jié)果:
　　 1 ATRA誘導KLF4和RARα表達
　　 以10μMATRA刺激VSMC0、6、12、24 h后,提取細胞總蛋白和RNA,分別進行Wes

4、tern blot分析和RT-PCR。結(jié)果顯示,隨著ATRA刺激時間的延長,KLF4的表達水平呈時間依賴性升高,同時RARα表達水平亦顯著增高,提示RARα可能參與ATRA誘導KLF4的表達。
　　 2 RARα介導ATRA誘導的KLF4表達
　　 應用RARtα拮抗劑Rα41-5253(20μM)預處理VSMC1 h后,ATRA(10μM)刺激VSMC24 h,分別提取細胞總蛋白和RNA,進行Westernblot分析

5、和RT-PCR。結(jié)果顯示,應用RARα抑制劑預處理細胞后,ATRA上調(diào)KLF4表達的作用受到抑制。為了進一步驗證RARα是否介導ATRA誘導的KLF4表達,將RARα的特異性小干擾RNA(RARα-siRNA)導入VSMC,阻斷內(nèi)源性RARα表達后,檢測KLF4的表達變化。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染RARα-siRNA的細胞與轉(zhuǎn)染NS-siRNA的對照組相比,ATRA對KLF4表達的誘導作用被抑制,表明RARα介導ATRA對KLF4表達的誘導作用。

6、
　　 3 ATRA激活p38 MAPK、抑制ERK信號通路
　　 為了探討ATRA通過哪些信號途徑激活KLF4基因表達,應用ATRA(10μM),刺激VSMC0、15、30、60 min后,分別檢測ERK、p38 MAPK、Akt及β-catenin的磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATRA刺激15 min后,ERK的磷酸化水平降低,p38 MAPK的磷酸化水平顯著升高,ATRA刺激不影響Akt和β-catenin的磷酸化水平。

7、表明ATRA能夠抑制ERK信號通路,激活p38MAPK通路。
　　 4 RARα通過ERK和p38 MAPK信號調(diào)節(jié)KLF4基因表達
　　 為了進一步探討RARα在ATRA誘導KLF4基因表達中的作用,應用RARα拮抗劑Ro41-5253預處理VSMC1 h后,ATRA刺激VSMC1 h。Western blot分析發(fā)現(xiàn),ERK磷酸化水平與對照組相比明顯升高,p38磷酸化水平顯著降低。此外,應用RARα-siRNA轉(zhuǎn)染V

8、SMC,敲低內(nèi)源性RARα表達后,ERK磷酸化水平與對照組相比升高,p38 MAPK磷酸化水平顯著降低,表明RARα通過ERK和p38 MARK信號調(diào)節(jié)KLF4基因表達。
　　 5 p38 MAPK信號介導ATRA誘導的KLF4表達
　　 為了進一步證明ATRA誘導KLF4表達與p38 MAPK和ERK信號通路的相關性,分別用p38 MAPK特異性抑制劑SB203580(20μM),ERK抑制劑PD98059(20μM)

9、及Akt抑制劑LY294002(20μM)預孵育VSMC2 h后,給予ATRA刺激24 h,收集細胞進行Western blot分析。結(jié)果顯示,抑制p38 MAPK信號途徑可使ATRA誘導KLF4表達的作用受到抑制,抑制ERK信號途徑上調(diào)KLF4表達,抑制Akt信號途徑不影響ATRA對KLF4表達的誘導作用。為了進一步驗證ERK信號途徑在ATRA誘導KLF4表達中的作用,應用ERK的持續(xù)活化型質(zhì)粒pCMV-MEKca轉(zhuǎn)染VSMC,ATR

10、A刺激細胞24 h后,收集細胞檢測KLF4的表達。Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pCMV-MEKca的細胞與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒(pCMV)的細胞相比,ATRA誘導KLF4表達的作用受到抑制。以上結(jié)果表明,p38 MAPK和ERK信號通路在ATRA調(diào)節(jié)KLF4基因表達中發(fā)揮重要的作用。
　　 結(jié)論:
　　 1在VSMC中,ATRA誘導KLF4和RARα表達。
　　 2 RARα介導ATRA對KLF4基因表達的誘導