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文檔簡介
1、目的:Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor4,KLF4)與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關,在不同環(huán)境下其對腫瘤具有雙重調(diào)節(jié)功能,KLF4基因既可以抑制轉錄過程又可以激活轉錄的發(fā)生,在腫瘤中既可以作為促癌因子又可能是抑癌因子。相應的,KLF4在不同腫瘤中的表達存在多樣性,或發(fā)揮癌基因作用,或具備抑癌基因作用。在本研究中我們擬檢測KLF4在人胃癌細胞系MKN-45及人正常胃黏膜上皮細胞系GES-1中的表達情況,并結合
2、KLF4基因啟動子區(qū)的生物信息學分析,預測胃癌發(fā)生過程中可能的轉錄調(diào)控因子,為深入研究其轉錄-調(diào)控機制提供研究基礎。
方法:選擇人胃癌細胞株MKN-45及人正常胃黏膜上皮細胞株GES-1,提取細胞株RNA,逆轉錄成cDNA,采用實時熒光定量PCR方法分別檢測以上兩種細胞中的KLF4 mRNA表達水平;運用生物信息學方法獲取KLF4基因基本信息、啟動子序列ID,為克服單個軟件的局限性,分別通過PromotorScan、Patch
3、、P-Match、AliBaba2在線預測軟件分析人KLF4基因啟動子序列,預測人KLF4基因啟動子區(qū)順式作用元件及相關轉錄因子,最后利用基因表達譜數(shù)據(jù)庫獲取胃癌組織中異常表達的蛋白,結合轉錄因子結果篩選出人胃癌KLF4基因可能涉及的轉錄因子。
結果:實時熒光定量PCR檢測結果顯示:KLF4 mRNA在人胃癌細胞株MKN-45中的表達低于人正常胃黏膜細胞株GES-1中的表達(4.24±0.15 vs6.66±0.23),差異具
4、有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。通過對KLF4基因啟動子區(qū)域的生物信息學分析,獲得人KLF4基因ID:9314,定位于9q31,全長4915 bp,其mRNA ID:NM_004235.4,該基因啟動子ID:HPRM23684,全長1319 bp。各軟件分析KLF4啟動子序列,其中PromotorScan獲得57個轉錄因子結合位點,涉及17個轉錄因子,包括ATF、EGR-1、GCF、H4TF1、MLTF、MT-I.6、Sp1等。Patch
5、獲得562個轉錄因子結合位點,涉及113個轉錄因子,包括AP-1、H4TF1、LEF-1、NF-1、Pax-5、SRF、SMAD-4等。P-Match參數(shù)設置為“減少錯誤率”時,獲得18個轉錄因子結合位點,涉及9個轉錄因子,包括AP-4、ARP-1、ATF、NF-E2等;參數(shù)設置為“減少假陰性”時,獲得295個轉錄因子結合位點,涉及25個轉錄因子,包括AP-4、ATF、CREB、NF-1、NF-E2、YY1等。AliBaba2獲得172
6、個轉錄因子結合位點,涉及52個轉錄因子,包括AP-2、ATF、NF-1、Sp1、USF、YY1等。以上四種軟件結果經(jīng)匯總去重,共涉及183個轉錄因子。另外,通過在線基因表達譜數(shù)據(jù)庫,獲得胃癌中異常表達的蛋白共3249個,與上述183個轉錄因子作對比篩查,提示在人胃癌中可能參與KLF4調(diào)控的轉錄因子有17個,包括LEF-1、NF-1、Pax-5、SMAD-4、SRF、YY1等。
結論:本研究檢測提示在胃癌細胞MKN-45中KLF
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