苯扎貝特對(duì)ox-LDL所誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1表達(dá)的影響及其機(jī)制.pdf

1、背景和目的：血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體(Lectin-like oxidized low density lipoprotein recaptor-1，LOX-1)是存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的氧化低密度脂蛋白(oxidized low-densitylipoprotein，ox-LDL)的特異性受體，二者特異性結(jié)合產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞的損傷效應(yīng)并觸發(fā)一系列的內(nèi)信號(hào)通路，參與高血壓、血栓癥和動(dòng)脈粥樣硬化(Artherosclerosis，AS

2、)等的形成。1型纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)是體內(nèi)主要的血漿纖溶酶原激活物抑制劑，調(diào)節(jié)和維持纖溶系統(tǒng)與凝血系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡。血漿PAI-1水平的升高與許多血栓性疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、心肌梗死、腦梗塞等密切相關(guān)。過(guò)氧化體增殖物激活型受體α(peroxisome proliferators-activated receptors alaph，PPARα)是一類由

3、配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，在機(jī)體生理和病理過(guò)程中具有多方面的重要功能。它可以調(diào)節(jié)致動(dòng)脈粥樣硬化、血管炎癥反應(yīng)，斑塊不穩(wěn)定以及血栓形成的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。因此，PPARα在血管壁上發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化。苯扎貝特是人工合成的外源性PPARα的激活物，它對(duì)ox-LDL所誘導(dǎo)的HUVECs表達(dá)LOX-1、PAI-1的影響及其機(jī)制尚不十分明確。本課題采用了分子生物學(xué)方法就此做了研究，共分為兩個(gè)部分：第一部分LOX-1對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)

4、的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1、PAI-1的表達(dá)的影響目的：用不同濃度的ox-LDL干預(yù)后內(nèi)皮細(xì)胞后，觀察ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1和LOX-1表達(dá)的影響及LOX-1在其中的作用。 方法： 體外培養(yǎng)HUVECs，采用形態(tài)學(xué)及抗Ⅷ因子抗體免疫熒光染色行內(nèi)皮細(xì)胞鑒定。選擇生長(zhǎng)良好的第2～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：①正常對(duì)照組：普通培養(yǎng)基；②不同濃度ox-LDL組：培養(yǎng)基中分別加入終濃度為10ug/mL、25ug/mL、

5、50ug/mL、100ug/mL的ox-LDL培養(yǎng)24h；③LOX-1阻滯劑組：加終濃度為250ug/mL Poly(I)預(yù)先作用2h,然后再加終濃度為50ug/mLox-LDL，培養(yǎng)24h。采用倒置顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化，通過(guò)RT-PCR測(cè)定LOX-1、PAI-1mRNA表達(dá)，Western-blot測(cè)定LOX-1蛋白的表達(dá)，Elisa方法測(cè)定PAI-1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.熒光顯微鏡下觀察顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞

6、結(jié)構(gòu)清晰，胞漿豐富，核呈綠色或黃綠色熒光，處理24h后的綠色熒光強(qiáng)度弱減，紅色熒光明顯加強(qiáng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，胞漿減少。在ox-LDL基礎(chǔ)上加入LOX-1阻滯劑后，上述作用明顯減弱。 2.不同濃度的ox-LDL可以上調(diào)LOX-1、PAI-1 mRNA表達(dá)，與正常對(duì)照組比較皆具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001)。此外，在本研究所限ox-LDL濃度范圍內(nèi)，HUVECs LOX-1及PAI-1mRNA表達(dá)與ox-LDL濃度呈明顯的劑量-效應(yīng)(

7、采用Person相關(guān)分析P＜0.01)關(guān)系。 3.不同濃度的ox-LDL可以上調(diào)LOX-1、PAI-1蛋白表達(dá)，與正常對(duì)照組比較，皆具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.01)，在本研究所限ox-LDL濃度范圍內(nèi)，HUVECs LOX-1及PAI-1蛋白表達(dá)與ox-LDL濃度呈明顯的劑量.效應(yīng)(采用Person相關(guān)分析P＜0.01)關(guān)系。 4.用250ug/mL poly(1)與HUVECs預(yù)先作用2h后，再加入50ug/mL的ox-LDL培養(yǎng)

8、24h，與未加poly(1)相比，LOX-1和PAI-1 mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯減少(p＜0.05)； 結(jié)論： 1.證實(shí)了ox-LDL可以誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1 mRNA和蛋白的高表達(dá)，呈濃度依賴關(guān)系，且部分通過(guò)LOX-1。 2.證實(shí)ox-LDL可以誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1 mRNA和蛋白的高表達(dá)，呈濃度依賴關(guān)系，此作用的機(jī)制研究表明可能部分通過(guò)LOX-1介導(dǎo)。 第二部分苯扎貝特對(duì)ox-

9、LDL對(duì)所誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PAI-1表達(dá)的影響及機(jī)制研究目的：觀察苯扎貝特對(duì)ox-LDL所誘導(dǎo)的HUVECs表達(dá)LOX-1、PAI-1 mRNA及蛋白的影響并探討其作用機(jī)制。 方法：體外培養(yǎng)HUVECs，采用形態(tài)學(xué)及抗Ⅷ因子抗體免疫熒光染色行內(nèi)皮細(xì)胞鑒定。選擇生長(zhǎng)良好的第2～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：①ox-LDL組：培養(yǎng)基中加入終濃度50mg/L ox-LHUVECsDL培養(yǎng)24h；②苯扎貝特組：50、100、200mm

10、ol/mL苯扎貝特預(yù)先作用內(nèi)皮細(xì)胞2h，再加入終濃度為50mg/L ox-LDL培養(yǎng)24h；③LOX-1阻滯劑組+100mmol/mL苯扎貝特：終濃度為250mg/L Poly(I)預(yù)先作用內(nèi)皮細(xì)胞2h后，加入終濃度為100mmol/mL苯扎貝特預(yù)先作用內(nèi)皮細(xì)胞2h，最后加入終濃度為50mg/L ox-LDL培養(yǎng)24h。通過(guò)RT-PCR測(cè)定LOX-1、PAI-1 mRNA表達(dá)，Western-blot、Elisa分別測(cè)定LOX-1、PA

11、I-1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.不同濃度苯扎貝特(50、100、200mmol/mL)組，與50mg/L ox-LDL組比較，LOX-1與PAI-1 mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯減少(P＜0.05)，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，濃度越大，減少的越明顯(P＜0.05)； 2.poly(Ⅰ)+100mmol/mL苯扎貝特組，與100mmol/mL苯扎貝特組比較，LOX-1與PAI-1mRNA和蛋白的表達(dá)顯著減少(P＜0.05