骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎肺組織E-選擇素表達(dá)的影響和意義.pdf

1、重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是病情復(fù)雜險(xiǎn)重、并發(fā)癥累及廣泛、病死率較高的難治性疾病。急性期易誘發(fā)急性肺損傷(acute lung injury,ALI),引起毛細(xì)血管膜彌散性破壞,出現(xiàn)肺水腫和肺不張,病情發(fā)展導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),目前臨床治療仍缺乏特異性和有效性。因此,ALI是SAP最常見、最嚴(yán)重全身并發(fā)

2、癥之一。肺富含大量毛細(xì)血管,血流豐富,SAP時(shí)過度釋放入血的炎癥介質(zhì)易導(dǎo)致肺成為炎性損傷最嚴(yán)重、最主要的靶器官之一。其中肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary vascular endothelial cells,PVEC)又是肺損傷時(shí)受累的重要靶細(xì)胞,病理狀態(tài)下,PVEC上異常表達(dá)的物質(zhì)能促進(jìn)血管內(nèi)循環(huán)的白細(xì)胞與其發(fā)生相互作用,進(jìn)而使白細(xì)胞附壁,破壞PVEC,并向血管外遷移,這是導(dǎo)致肺損傷的重要環(huán)節(jié)。E-選擇素(E-selectin,Es

3、)參與介導(dǎo)此過程,PVEC活性增加時(shí),其Es表達(dá)增高,而PVEC活性增加是血管病變的重要階段。因此,PVEC上Es的高表達(dá)有助于提示肺血管病變?cè)缙趦?nèi)皮細(xì)胞活化程度,是內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步損傷的征兆。最近研究報(bào)道,成體組織來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)對(duì)ALI具有免疫調(diào)節(jié)、修復(fù)微環(huán)境或替代損傷的肺組織細(xì)胞等生物學(xué)功能。本課題以大鼠SAP模型為研究對(duì)象,觀察肺組織Es動(dòng)態(tài)

4、變化特點(diǎn)。經(jīng)靜脈移植同種異體BMSCs,觀察其在損傷肺組織的分布定植,探討B(tài)MSCs移植對(duì)SAP大鼠肺組織Es表達(dá)及部分細(xì)胞因子水平的影響和意義。
　　【目的】
　　1.建立可靠、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好,具有顯著ALI表現(xiàn)的SAP動(dòng)物模型,了解大鼠SAP模型病程規(guī)律及病理改變,為下步實(shí)驗(yàn)研究提供良好的動(dòng)物模型基礎(chǔ)。
　　2.分析逆行膽胰管注射法制作的大鼠SAP模型誘發(fā)肺損傷嚴(yán)重程度,并探討該模型下肺組織Es變化規(guī)律,為下步SA

5、P肺損傷的干預(yù)研究提供依據(jù)。
　　3.建立體外分離、純化、快速擴(kuò)增SD大鼠BMSCs的科學(xué)方法,以獲得足夠BMSCs,并分析部分表型特征。為下步運(yùn)用BMSCs移植治療SAP肺損傷模型的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)材料。
　　4.通過BMSCs移植干預(yù)大鼠SAP模型誘發(fā)的肺損傷,檢測(cè)肺組織Es含量、炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β水平等。探討B(tài)MSCs能否可通過抑制肺組織Es表達(dá)及炎癥介質(zhì)釋放,對(duì)SAP肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。
　　【方法

6、】
　　1.經(jīng)膽胰管逆行注射5％脫氧?；悄懰徕c建立SAP模型:清潔級(jí)雄性SD大鼠,隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組(SAP)和假手術(shù)組(SO)。10%水合氯醛腹腔麻醉,暴露胰腺,辨認(rèn)膽胰管,夾閉靠近肝門段的膽胰管,經(jīng)膽胰管逆行注射5%脫氧?；悄懰徕c,縫扎膽胰管遠(yuǎn)端;SO組僅翻動(dòng)按摩胰腺。術(shù)后補(bǔ)液支持。觀察2組大鼠48h生存質(zhì)量,于3h、6h、12h、24h分批處死大鼠,分析血清淀粉酶、白蛋白、Ca2+水平及胰腺病理改變。評(píng)價(jià)該模型嚴(yán)重程度和制作方式

7、的可行性。
　　2.清潔級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組(SAP)、假手術(shù)組(SO),膽胰管逆行注射5%脫氧牛磺膽酸鈉制作大鼠SAP模型。觀察3h,6h,12h,24h兩組動(dòng)物肺濕/干重比,肺組織病理改變;實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)法觀察肺組織Es變化。
　　3.全骨髓差異貼壁法培養(yǎng)獲取BMSCs:無菌條件下,分離幼齡SD大鼠雙側(cè)脛股骨。DMEM/F12緩慢沖洗骨髓腔,離心骨髓細(xì)胞懸液,用1%青鏈霉素-10%FBS的DME

8、M/F12吹打重懸,以2×105/m1接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶。靜置于37°C,飽和濕度,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況,并按1:2或1:3傳代擴(kuò)增。收獲生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29+CD90+CD34-CD45-細(xì)胞群,分析BMSCs純度。
　　4.逆行膽胰管注射5%脫氧?；悄懰徕c制作大鼠SAP模型,隨機(jī)取4只用于BMSCs示蹤觀察,其余隨機(jī)分成對(duì)照組(Control-SAP)、BMSCs治療組

9、(BMSCs-SAP)和MP治療組(MP-SAP)。P3代BMSCs制成1×106/ml細(xì)胞懸液,建模后1h經(jīng)尾靜脈按1ml細(xì)胞懸液/100g體重輸注大鼠體內(nèi)(干細(xì)胞示蹤大鼠輸入CM-DiI標(biāo)記的BMSCs);對(duì)照組和MP治療組分別注射等體積量生理鹽水和MP。觀察3h、6h、12h、24h各組大鼠血清淀粉酶、白蛋白、TNF-α、IL-1β水平,肺濕/干重比;肺與胰腺組織病理改變;實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)法分析肺組織Es表達(dá)變化。

10、BMSCs示蹤大鼠取肺組織快速冰凍,熒光顯微鏡下觀察CM-DiI陽性細(xì)胞(BMSCs)分布。
　　【結(jié)果】
　　1.SAP組大鼠表現(xiàn)為弓背、蜷曲、豎毛、不喜動(dòng)、呼吸困難等。腹腔血性腹水,胰腺膠凍樣壞死及皂化斑;病理顯示胰腺組織間隙增大,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),微血管破裂出血,腺泡細(xì)胞壞死,腺體結(jié)構(gòu)破壞等。與SO組同期相比,SAP組大鼠胰腺病理學(xué)評(píng)分、血清淀粉酶明顯升高;白蛋白、Ca2+水平降低(p<0.05),大鼠生存率下降。

11、　　2.與SO組大鼠相比,SAP組大鼠出現(xiàn)進(jìn)行性加重的呼吸衰竭表現(xiàn),病理顯示肺泡間隔增寬、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡腔內(nèi)滲液、出血,肺泡萎陷不張、部分實(shí)變等;肺濕/干重比及病理學(xué)評(píng)分增高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析,SAP組大鼠肺組織Es mRNA在3h即明顯增加,6h達(dá)高峰;免疫熒光組織化學(xué)顯示,Es蛋白分布于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜及胞漿中,表達(dá)程度較Es mRNA變化延遲,但趨勢(shì)較為相符。
　　3.培養(yǎng)的原代細(xì)胞24h后可見絕大多數(shù)已貼壁,呈

12、多角形、紡錘樣等混合形態(tài),至7~8d細(xì)胞匯合達(dá)90%,部分聚集形成集落。定期換液和傳代,細(xì)胞純化。第3代細(xì)胞形態(tài)均一,多呈稍寬的長(zhǎng)梭形,類似成纖維樣,“漩渦狀”排列增多。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示:CD29+CD90+CD34-CD45-細(xì)胞群占91.3%以上。免疫表型符合BMSCs表面抗原特征,為SAP模型肺組織Es干預(yù)研究提供細(xì)胞來源。
　　4.經(jīng)BMSCs移植的SAP大鼠精神好轉(zhuǎn),呼吸較平穩(wěn),口鼻無粉紅色泡沫出現(xiàn),48h生存率顯著提

13、高。熒光顯微鏡下,肺組織CM-DiI陽性細(xì)胞(BMSCs)分布呈時(shí)序性增加。與Control-SAP組相比,肺組織Es mRNA、Es蛋白表達(dá)及肺濕/干重比降低,胰腺和肺病理損害減輕;血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β等水平顯著降低,白蛋白升高。但BMSCs治療效果幾乎均顯著差于MP治療組(p<0.05)。
　　【結(jié)論】
　　1.采用經(jīng)膽胰管逆行注射5%脫氧?；悄懰徕c的方法建立SAP模型,可以引起胰腺嚴(yán)重的病理損害,出現(xiàn)SA

14、P呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥等相應(yīng)臨床表現(xiàn)。模型制作方法可靠易行,成功率高,適合作為研究對(duì)象。
　　2.SAP早期誘發(fā)不可逆的肺病理損傷及相應(yīng)肺功能損害表現(xiàn)。SAP肺損傷時(shí)導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞上E-選擇素表達(dá)增加極早出現(xiàn),肺血管內(nèi)皮細(xì)胞上Es表達(dá)變化陡增后緩慢下降。Es介導(dǎo)白細(xì)胞在血管內(nèi)壁的滾動(dòng)、附壁及遷移外滲過程。Es的增高早期反映了肺血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和內(nèi)皮屏障功能失衡。
　　3.經(jīng)全骨髓差異貼壁法獲取純度較高的BMSCs,流式細(xì)胞儀鑒

15、定符合BMSCs細(xì)胞表面抗原特征,P3代BMSCs含量達(dá)到91.3%以上。說明此法簡(jiǎn)單、適用、高效,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了充足的BMSCs來源。
　　4.同種異體BMSCs可遷移至SAP大鼠受損的肺組織,發(fā)揮保護(hù)與修復(fù)作用。BMSCs調(diào)節(jié)大鼠SAP時(shí)全身炎癥反應(yīng),抑制炎癥介質(zhì)過度釋放,減輕肺免疫損傷;同時(shí),降低肺血管內(nèi)皮細(xì)胞活性,減少Es表達(dá),阻止Es介導(dǎo)下白細(xì)胞與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附及外滲,保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)肺血管內(nèi)皮屏障功能修復(fù),有