骨髓間充質(zhì)干細胞不同時相干預對大鼠急性肺損傷炎性因子表達的影響及其治療作用.pdf

1、背景和目的：急性肺損傷（acute lung injury,ALI）是各種病因，包括肺內(nèi)因素和（或）肺外因素所致的肺泡上皮細胞和肺內(nèi)毛細血管內(nèi)皮損傷，并由此引起肺泡膜通透性改變、肺泡表面活性物質(zhì)被破壞、彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫、透明膜形成、肺泡萎陷。急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）則是急性肺損傷發(fā)生、發(fā)展的結果。盡管機械通氣策略的進步、體外膜肺氧合（extracorpo

2、real membrane oxygenation,ECMO）的出現(xiàn)，其病死率仍然居高不下。為了尋求更好的治療手段，學者們開始將目光聚焦在具有組織修復及再生能力的骨髓間充質(zhì)干細胞上。
　　骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）應用于ARDS的治療是一種非常有應用前景的手段，研究表明，BM-MSCs能夠歸巢于組織受損部位，并通過細胞免疫調(diào)節(jié)在受損部位的炎癥微環(huán)境中發(fā)揮

3、抗炎、抗水腫、減輕內(nèi)皮細胞通透性等作用，并且BM-MSCs能夠通過自身分泌抗菌肽、增強巨噬細胞吞噬能力、調(diào)節(jié)T細胞等方式，從而發(fā)揮抗菌作用。此外，近年研究表明，BM-MSCs可能通過線粒體跨細胞轉(zhuǎn)移到ALI/ARDS的受損肺泡上皮細胞中，挽救損傷的肺泡上皮，從而減少肺水腫的可能。
　　盡管BM-MSCs具備眾多抗炎作用以及治療急性炎癥所致肺部疾病效果較理想，然而臨床上應用其治療慢性炎癥所致肺部疾病仍有爭議。因此，探究BM-MSCs

4、不同時相干預對急性肺損傷的炎癥因子變化及修復作用能在臨床應用提供一定的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、通過從SD大鼠長骨中提取骨髓細胞，通過細胞貼壁法分離及純化骨髓間充質(zhì)干細胞；
　　2、BM-MSCs傳代至第3代后，通過定向誘導，誘導其向成骨、成脂肪、成軟骨方向分化；
　　3、利用免疫熒光抗體對該細胞表面CD分子標記，通過流式細胞術對細胞表面CD分子陽性表達率進行檢測，對所培養(yǎng)的BM-MSCs進行鑒定；

5、　　4、急性肺損傷動物模型主要通過尾靜脈注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）構建SD大鼠急性肺損傷動物模型，并通過病理評分及動物動脈血氣分析檢測建模情況，動物病理評分參照2011年《美國胸科協(xié)會動物急性肺損傷病理評分》進行評分；
　　5、120只SD大鼠隨機分成N組（對照組）、L組（LPS組）及L+M組（LPS+MSCs組），每組40只，并根據(jù)MSCs干預的不同時間將各組分成2h、8h、24h、48h、96h

6、五個亞組，每亞組8只；N組動物給予等劑量PBS注射，L組均在起始時間尾靜脈注射LPS，劑量為5mg/kg，分別在上述時相予1x106/ml X1ml的劑量MSCs處理后的24h檢測支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中炎性細胞、炎性標記物（TNF-α、IL-1α、IL-10）、動脈血血氣分析、肺組織病理評分等。
　　結果：
　　1、成功分離、培養(yǎng)并純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞

7、r>　　成功分離出骨髓貼壁細胞，將其純化后，誘導其向成脂、成骨、成軟骨分化，具備多向分化潛能；流式細胞術檢測細胞表面CD分子結果為，CD90，CD105陽性率分別為98.89％，97.37%（強表達間充質(zhì)抗原標記物）；CD45，CD34陽性率分別為3.17%，1.41%（弱表達血管內(nèi)皮表面抗原標記物及造血系細胞表面抗原標記物）。結果表明所分離純化的細胞即為大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　2、脂多糖明顯降低大鼠PaO2，BM-MSCs干

8、預使PaO2升高在2h顯著
　　與同時相N組相比，2hL組、8hL組、24hL組、48hL組PaO2均有明顯下降（P＜0.01）；與同時相L組比較，2h L+M組PaO2明顯升高（P＜0.05），而其余L+M組無明顯差異（P＞0.05）。
　　3、脂多糖明顯升高BALF中TNF-α、IL-1α、IL-10濃度，BM-MSCs干預可明顯降低BALF中TNF-α、IL-1α濃度，并明顯升高IL-10濃度
　　TNF-α濃度

9、比較：與同時相N組相比，各時相的L組TNF-α濃度均明顯增加（P＜0.05）；與同時相L組比較，2hL+M組、8hL+M組、24hL+M組、48hL+M組TNF-α濃度均明顯降低（P＜0.05），而其余組無明顯差異（P＞0.05）。 IL-1α濃度比較：與同時相N相比，各時相的L組IL-1α濃度均明顯增加（P＜0.05）；與同時相L組比較，2hL+M組、8hL+M組、24hL+M組IL-1α濃度降低（P＜0.01），而其余L+M組無顯著

10、性差異（P＞0.05）。IL-10濃度比較：與同時相N組相比，2hL組、8hL組IL-10的濃度明顯增加（P＜0.01），而其余L組無顯著性差異；與同時相L組比較，各時相L+M組IL-10的濃度均增加（P＜0.05）。
　　4、脂多糖使BALF中PMN明顯增多，BM-MSCs干預使PMN降低在2h、8h顯著
　　與同時相N組相比，各時相L組PMN總數(shù)均有明顯增加（P＜0.01）；與同時相L組比較，2hL+M組、8hL+M組P

11、MN總數(shù)明顯下降（P＜0.05），其余L+M組無顯著性差異（P＞0.05）。
　　5、脂多糖使肺濕/干（W/D）明顯增加，BM-MSCs干預使PMN降低在2h、8h、24h顯著
　　與同時相N組相比，各時相L組W/D均有增加（P＜0.01）；與同時相L組比較，2hL+M組、8hL+M組、24hL+M組W/D均有降低（P＜0.05），而其余L+M組雖W/D無顯著性差異（P＞0.05）。
　　6、脂多糖導致急性肺損傷，BM

12、-MSCs干預對脂多糖誘導急性肺損傷病理評分降低在2h、8h、24h顯著
　　與同時相N組比較，各時相L組ALI病理評分均有增加（P＜0.05）；與同時相L組比較，2hL+M組、8hL+M組、24hL+M組ALI病理評分均有下降（P＜0.05），而其余L+M組無顯著性差異。
　　結論：
　　1、從骨髓中體外分離出貼壁細胞，通過貼壁法純化細胞，將其進行定向誘導分化為骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞，并通過流式細胞術檢測細胞表面