骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎時(shí)自噬變化的影響及機(jī)制探討.pdf

1、目的：建立大鼠重癥急性胰腺炎模型。觀察急性胰腺炎發(fā)生過(guò)程中自噬活性的變化，探討其病理意義。觀察同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)重癥急性胰腺炎自噬的影響，闡明MSCs治療重癥急性胰腺炎的分子機(jī)制。
　　方法：將健康體重250±50克，5-6周齡的雌性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，SAP模型組，SAP+MSCs移植組。每只大鼠尾靜脈注射自噬雙標(biāo)腺病毒（mRFP-GFP-LC3）2×109，在室溫22-28℃，相對(duì)濕度40-70％的動(dòng)物房?jī)?nèi)

2、適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開(kāi)始造模，造模前12h起禁食不禁水。采用腹腔注射20％L-精氨酸的方法建立SAP大鼠模型，正常對(duì)照組給予等量生理鹽水腹腔注射。造模前一周取雄性健康SD大鼠做MSCs培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的同種異體SD大鼠第三代MSCs作為種子細(xì)胞，在SAP+MSCs移植組大鼠腹腔注射第一次精氨酸后即開(kāi)始尾靜脈注射，注射量為5×106個(gè)/只，SAP模型組及正常對(duì)照組均予尾靜脈注射同體積0.9％NaCl溶液，所有大鼠均禁食不禁水。分別在開(kāi)始造模6h

3、、12h、24h、48h、72h，分別在三組動(dòng)物中抽取靜脈血，分離制作血清，-200C保存，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)血淀粉酶、IL-6、TNF-α、以及胰蛋白酶原激活肽的含量。分別在以上5個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組分別處死5只動(dòng)物，打開(kāi)腹腔，觀察胰腺周圍有無(wú)水腫及滲出。按上述固定的各時(shí)間點(diǎn)取胰腺、肺、腎組織標(biāo)本，石蠟包埋，切片，HE染色，采用盲法在光鏡下讀片，進(jìn)行胰腺組織病理學(xué)評(píng)分；同時(shí)做石蠟切片在熒光顯微鏡下采用 GFP-LC3等融合蛋白來(lái)示蹤自噬形成，免疫

4、印跡法檢測(cè)大鼠胰腺組織LCⅡ，以及12h大鼠胰腺組織PI3K、p-PI3K、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)，用Image J軟件分析蛋白條帶進(jìn)行灰度值計(jì)算，得到目的蛋白的相對(duì)含量。全部數(shù)據(jù)使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以?x±s表示，兩樣本均數(shù)比較采取t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:與正常對(duì)照組相比，SAP組胰腺組織充血水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分胰腺結(jié)構(gòu)模糊甚至消失；胰腺組織病理學(xué)評(píng)分增加，血清淀

5、粉酶、胰蛋白酶原激活肽、TNF-α和IL-6水平均升高(P<0.05)。熒光顯微鏡下觀察SAP組大鼠胰腺組織自噬相關(guān)超微結(jié)構(gòu)明顯增多，免疫印跡法顯示與對(duì)照組相比，6h、12hSAP組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)顯著增多（p<0.05)；與模型組相比，移植組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分下降，血清淀粉酶、胰蛋白酶原激活肽、TNF-α和IL-6水平均降低(P<0.05)，免疫印跡法顯示與SAP組相比，移植組大鼠自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ有所減少（p<0.05

6、)；24h、48h、72h三組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0．05）。12h胰腺組織PI3K、p-PI3K、mTOR、p-mTOR蛋白的表達(dá)顯示，3組PI3K、mTOR蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P〉0.05），與對(duì)照組相比，模型組p-PI3K、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯增加（p<0.05)；與模型組相比，移植組p-PI3K、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯降低(P<0．05)。
　　結(jié)論:重癥急性胰腺炎可誘導(dǎo)增強(qiáng)自噬的發(fā)生，自噬促進(jìn)胰蛋白酶原的激活，