兩株海洋真菌來源的混源萜類次級代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、真菌生物體內(nèi)存在著聚酮、聚異戊二烯、非核糖體多肽、莽草酸等多種生物合成途徑。不同生物合成途徑雜合偶聯(lián),再次重組,則形成雜合途徑。由雜合途徑產(chǎn)生的化合物稱之為混源代謝產(chǎn)物,混源萜是其中的一類,其廣泛存在于真菌、海洋無脊椎動(dòng)物以及高等植物中,該類化合物是由異戊二烯途徑與其它途徑的偶聯(lián)重組生成的。真菌來源的混源萜類化合物具有抗菌、免疫調(diào)節(jié)、植物毒素、真菌毒素、殺蟲等多種生物活性,因此,對于該類化合物的研究倍受關(guān)注。
　　 本論文選定實(shí)

2、驗(yàn)室菌株資源庫中保藏的兩株具有生產(chǎn)混源萜類化合物能力的海洋真菌菌株裸孢殼菌Emericella sp.(HK-ZJ)和鏈格孢菌Alternaria sp.(JJY-32),對其進(jìn)行次級代謝產(chǎn)物的研究。首先運(yùn)用萃取,薄層色譜,正相、反相硅膠柱色譜,LH-20凝膠柱色譜,反相高壓液相等化學(xué)分離純化手段從Emericella sp.(HK-ZJ)中共分離得到單體化合物20個(gè)(1-20),其中混源萜類化合物13個(gè)(4-16),包括6個(gè)新穎的異吲

3、哚酮-法尼基類混源萜emeriphenolicins A-F(4-9)和7個(gè)austin類混源萜(10-16),與此同時(shí)我們還分離得到了3個(gè)新穎的異吲哚酮類化合物emerimidine A-C(1-3)。實(shí)驗(yàn)室在前期對菌株JJY-32次級代謝產(chǎn)物研究工作中獲得9個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的混原萜類化合物(21-29),在本論文工作中我們引用OSMAC研究策略,對活性菌株JJY-32進(jìn)行混源萜類次級代謝產(chǎn)物多樣性開發(fā)。通過改變培養(yǎng)基條件,獲得了14個(gè)al

4、ternarene混源萜類化合物,其中新化合物8個(gè),分別為tricloalternarene A-G(30-36)和tricloalternarene H(38);通過酶抑制劑鄰菲羅啉的添加擾動(dòng)了alternarene的混合生物合成,再次獲得了3個(gè)新穎的alternarene類混源萜monocloalternarene A-C(44-46)。
　　 采用二維NOESY、CD、構(gòu)象分析以及化學(xué)衍生化等相結(jié)合的方法確定了骨架新穎的二

5、環(huán)(21-24、26-27)、螺環(huán)(25)以及三環(huán)(30)alternarenes混源萜類化合物的絕對構(gòu)型,并進(jìn)一步推測了該系列混源萜類化合物(21-46)的生源關(guān)系以及骨架轉(zhuǎn)化中可能存在的立體化學(xué);采用添加酶抑制劑以及化學(xué)中間體的方法確定了JJY-32中alternarenes混源萜類化合物的生物合成起源于莽草酸途徑和聚異戊二烯途徑的混合途徑。
　　 以H1N1病毒感染狗腎上皮細(xì)胞(MDCK)模型采用細(xì)胞病變抑制效應(yīng)(CPE)

6、分析方法評價(jià)了化合物1-9的抗病毒活性,發(fā)現(xiàn)異吲哚酮衍生物1-3具有中等強(qiáng)度的協(xié)助宿主細(xì)胞抵抗病毒侵染活性,IC50值分別為42.07、62.05和60.18μM;采用海蝦致死模型評價(jià)austin類混源萜10-16的殺蟲活性,發(fā)現(xiàn)化合物10、13-15對海蝦(Artemia salind)表現(xiàn)出了不同程度的致死活性,特別是化合物14對海蝦的半數(shù)致死濃度達(dá)到了7.2 ppm。
　　 利用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)炎癥因子模

7、型,MALP-2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和239T表達(dá)TLR受體模型等炎癥模型,采用EIASA、RT-PCR、Western Blot、激光共聚焦顯微鏡等檢測方法對alternarene混源萜類化合物37進(jìn)行分子靶點(diǎn)水平的抗炎活性評價(jià)。發(fā)現(xiàn)其能阻斷TLR/MyD88/NF-κB通路中P38和Akt蛋白的磷酸化激活,進(jìn)而抑制通路中NO,IL-1β和IL-6等各種炎癥因子的表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用。
　　 利用NF-κB熒光素酶報(bào)告基因(NF-κB-

8、luc)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HT29模型以化合物37為參照,對比評價(jià)了其它alternarenes混源萜類化合物的抗炎活性。在相同的濃度條件下(100μmol/L),新化合物33和34均表現(xiàn)出了高于化合物37的活性,新化合物31.32以及已知化合物39、41-42表現(xiàn)出了與化合物37相當(dāng)?shù)目寡谆钚浴?br>　　 綜上所述,本文對兩株海洋來源的真菌次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,得到emeriphenolicins類、austin類和alte

9、rnarenes類共計(jì)30個(gè)混源萜化合物,其中新化合物17個(gè),化合物45-46具有天然罕見的環(huán)己烯酮-法尼基骨架結(jié)構(gòu);并利用二維NOESY、CD、構(gòu)象分析以及化學(xué)衍生化等相結(jié)合的方法確定了骨架新穎的多手性中心的二環(huán)及三環(huán)alternarenes類化合物的絕對構(gòu)型;采用添加酶抑制的以及中間體互補(bǔ)的方法推測了alternarenes類混源萜的生物合成過程;發(fā)現(xiàn)了alternarenes類混源萜能夠通過阻斷TLR/MyD88/NF-κB通路而