齊口裂腹魚生長激素基因的克隆、原核表達(dá)及生物活性初步研究.pdf

1、本研究選用齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)作為實(shí)驗(yàn)材料，從齊口裂腹魚腦垂體中提取總RNA。設(shè)計(jì)合成了一對齊口裂腹魚生長激素基因的特異性引物，上游引物加入EcoRI酶切位點(diǎn)；下游引物加入XholI酶切位點(diǎn)。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)克隆得到編碼齊口裂腹魚生長激素(SGH)基因的cDNA，并定向克隆到pMD18-T載體上。正反向測序結(jié)果分析表明：克隆的齊口裂腹魚生長激素基因cDNA全長633bp，包

2、含完整的開放閱讀框(ORF)，編碼210個氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明其分子量為23.55KD，等電點(diǎn)為5.46；疏水氨基酸占36.7％，親水氨基酸占28.57％，堿性氨基酸占10.47％，酸性氨基酸占12.38％。將得到的序列在GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了同源比較，結(jié)果顯示：本研究克隆到的齊口裂腹魚GH基因與GenBank中登記的其他鯉科魚類的生長激素基因的同源性在92％-97％之間，影響蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的保守二硫鍵為2個。

3、 將齊口裂腹魚生長激素成熟肽(mSGH)基因片段定向插入融合表達(dá)載體pET-32a(+)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用PCR方法篩選陽性克隆；以XholI和EcoRI酶切鑒定重組質(zhì)粒。以IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，SDS-PAGE分析表明mSGH以融合蛋白的形式得到了表達(dá)，分子量約為41KD，與預(yù)期的大小一致。融合蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白量的42.6％。證明所構(gòu)建的齊口裂腹魚GH的重組質(zhì)粒能高效表達(dá)，命名為pET-mSGH。