軍曹魚生長激素基因(GH)的克隆和表達(dá).pdf

1、生長激素(Growth Hormone)是GH/PRL/SL家族的一個成員,其功能是對魚類的生長發(fā)育、繁殖等起著非常重要的調(diào)控作用。DNA重組技術(shù)為GH基因重組提供了可能性,實(shí)現(xiàn)了外源生長激素在魚體中的促生長作用。本論文以軍曹魚為研究對象,對該魚的生長激素(GH)基因進(jìn)行克隆和原核表達(dá),并對GH基因在軍曹魚各組織中的表達(dá)分布進(jìn)行了分析。
　　 根據(jù)鱸形目GH基因氨基酸序列的同源性設(shè)計(jì)了一對簡并性引物來擴(kuò)增軍曹魚腦垂體cDNA,獲

2、得了軍曹魚GH基因cDNA片段后用同源克隆的方法獲得了軍曹魚GH基因3’和5’非編碼區(qū)域,進(jìn)而得到軍曹魚GH基因全長cDNA序列。最后通過設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增軍曹魚腦垂體基因組DNA,獲得了內(nèi)含子的序列。該基因序列全長1780bp,其中5’端非編碼區(qū)為(5’-UTR)77 bp,3’端非編碼區(qū)(3’-UTR)為170 bp,整個開放閱讀框(OFR)長1533 bp,包括5個外顯子和4個內(nèi)含子,cDNA序列全長615 bp,編碼204個氨基

3、酸,其中含22個信號肽和182個成熟肽,預(yù)測分子量約為23.17 kDa,理論等電點(diǎn)為6.43。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),軍曹魚GH基因與哺乳動物和四腳動物的同源性低于40％,與鱸形目魚類的同源性高于80％,其中與鲯鰍的同源性最高,同源性達(dá)到97.5％。
　　 生長激素是生長軸(GH—IGF-1)的重要組成部分,它控制魚類的生長和發(fā)育。生長激素通過結(jié)合肝細(xì)胞膜受體后在許多組織中起作用,本研究通過實(shí)時熒光定量PCR方法,分析了GH基因在

4、成體軍曹魚10個組織的表達(dá)差異,結(jié)果表明,GH基因在軍曹魚腦垂體中表達(dá)量最高,其次是性腺,而在肝臟,腦,心臟,腎臟,脾臟,胃,肌肉和鰓中有極少的表達(dá)量。
　　 采用T-A克隆構(gòu)建pMD18-T-CoGH重組質(zhì)粒,測序正確后經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切獲得CoGH片段,插入表達(dá)載體pET-28a,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物通過SDS-PAGE顯示為分子量23kDa的蛋白條帶,經(jīng)過western blo

5、tting檢測后發(fā)現(xiàn)目的蛋白與His抗體特異性結(jié)合,證明目的基因在大腸桿菌中成功表達(dá)。
　　 本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了GH基因在大腸桿菌中的表達(dá)條件,從宿主菌、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)劑的濃度等方面進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)顯示軍曹魚GH基因在宿主菌BL21中不表達(dá),而在BL21(DE3)中則大量表達(dá)。該基因在溫度為37℃,誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為1 mmol/L時誘導(dǎo)4 h,蛋白的表達(dá)量最大,但可溶性較差。通過超聲波破碎實(shí)驗(yàn)證明該基因隨著溫度的降低蛋