羅非魚(yú)肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子與生長(zhǎng)激素基因的克隆及在真核細(xì)胞中的活性表達(dá).pdf

1、羅非魚(yú)是世界性主要養(yǎng)殖魚(yú)類，養(yǎng)殖范圍已遍布105個(gè)國(guó)家和地區(qū)，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)向全世界推廣養(yǎng)殖的優(yōu)良品種。由于它具有味美、無(wú)脊間刺、易加工的優(yōu)點(diǎn)，在許多國(guó)家正被作為海洋捕撈魚(yú)類的替代品。隨著世界海洋漁業(yè)資源量的減少，羅非魚(yú)在國(guó)際水產(chǎn)品貿(mào)易中的地位越來(lái)越重要，交易量（額）逐年上升。
　　 通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以培育出生長(zhǎng)快速、抗逆羅非魚(yú)，為此我們通過(guò)分子生物學(xué)手段獲得了兩個(gè)構(gòu)成轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的重要元件：肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子和生

2、長(zhǎng)激素基因.所以本研究?jī)?nèi)容包括兩部分：
　　 以尼羅羅非魚(yú)基因組DNA為模板，使用高保真PCR方法分離得到1675bp的β-actin基因啟動(dòng)子，且已知的典型調(diào)控序列并未發(fā)生變化。通過(guò)序列測(cè)定并與其他魚(yú)類及人類β-actin基因啟動(dòng)子相比較，發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚(yú)β-actin基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)具有典型的啟動(dòng)子特征，含有TATA Box、CArG和CCAAT Box3個(gè)重要的順勢(shì)作用元件。同時(shí)成功構(gòu)建了CMV啟動(dòng)子缺失的含有β-actin

3、基因啟動(dòng)子及EGFP基因的重組表達(dá)載體pEGFP-β-actin，并通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將重組表達(dá)載體pEGFP-β-actin轉(zhuǎn)到NIH293T細(xì)胞中。熒光顯徼鏡觀察到NIH293T細(xì)胞中發(fā)出綠色熒光，結(jié)果表明尼羅羅非魚(yú)β-actin基因啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)EGFP的表達(dá)，證實(shí)在真核細(xì)胞水平尼羅羅非魚(yú)β-actin基因啟動(dòng)子具有較好的表達(dá)活性。
　　 從尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)腦垂體中分離其總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)

4、錄合成為第一條cDNA鏈，再以第一條cDNA為模板，經(jīng)過(guò)RT-PCR，克隆得到全長(zhǎng)785bp的生長(zhǎng)激素基因，序列分析表明：GH開(kāi)放閱讀框?yàn)?15bp，共編碼204個(gè)氨基酸；其中含有17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和187個(gè)氨基酸的成熟GH序列。同時(shí)我們將其插入到載體啟動(dòng)子下游，與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)報(bào)告基因融合，重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測(cè)序進(jìn)行鑒定。通

5、過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染分別將pEGFP-GH重組表達(dá)載體、pEGFP-N1轉(zhuǎn)到293T細(xì)胞中，以檢測(cè)尼羅羅非魚(yú)GH基因表達(dá)的活性。結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組pEGFP-N1，有熒光表達(dá)的細(xì)胞占90％以上；pEGFP-GH可見(jiàn)綠色熒光，但是有熒光表達(dá)的細(xì)胞較少，強(qiáng)度較弱。上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明，所獲得的尼羅羅非魚(yú)GH基因具有較好的表達(dá)活性，能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)。
　　 本研究成功獲得了尼羅羅非魚(yú)β-actin基因啟動(dòng)子和GH基因，同時(shí)通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染首次在

6、真核細(xì)胞中有力的證實(shí)了其具有一定的生物活性；為進(jìn)一步驗(yàn)證尼羅羅非魚(yú)β-actin基因啟動(dòng)子和GH基因的生物活性，本試驗(yàn)還嘗試將其轉(zhuǎn)染到不同的真核細(xì)胞中，如Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞），仍然能夠觀察到有熒光發(fā)出，但強(qiáng)度要比在293T細(xì)胞中弱，這可能與細(xì)胞的特性有關(guān)?？傊?，本試驗(yàn)成功獲得了有生物活性的尼羅羅非魚(yú)β-actin基因啟動(dòng)子和GH基因，為將來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因尼羅羅非魚(yú)研究提供了兩個(gè)重要的元件。
　　 此外，本人還對(duì)太湖鰱魚(yú)mt