羅非魚肌動蛋白基因啟動子與生長激素基因的克隆及在真核細胞中的活性表達.pdf

1、羅非魚是世界性主要養(yǎng)殖魚類，養(yǎng)殖范圍已遍布105個國家和地區(qū)，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)向全世界推廣養(yǎng)殖的優(yōu)良品種。由于它具有味美、無脊間刺、易加工的優(yōu)點，在許多國家正被作為海洋捕撈魚類的替代品。隨著世界海洋漁業(yè)資源量的減少，羅非魚在國際水產(chǎn)品貿(mào)易中的地位越來越重要，交易量（額）逐年上升。
　　 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以培育出生長快速、抗逆羅非魚，為此我們通過分子生物學手段獲得了兩個構(gòu)成轉(zhuǎn)基因表達載體的重要元件：肌動蛋白基因啟動子和生

2、長激素基因.所以本研究內(nèi)容包括兩部分：
　　 以尼羅羅非魚基因組DNA為模板，使用高保真PCR方法分離得到1675bp的β-actin基因啟動子，且已知的典型調(diào)控序列并未發(fā)生變化。通過序列測定并與其他魚類及人類β-actin基因啟動子相比較，發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚β-actin基因啟動子調(diào)控區(qū)具有典型的啟動子特征，含有TATA Box、CArG和CCAAT Box3個重要的順勢作用元件。同時成功構(gòu)建了CMV啟動子缺失的含有β-actin

3、基因啟動子及EGFP基因的重組表達載體pEGFP-β-actin，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將重組表達載體pEGFP-β-actin轉(zhuǎn)到NIH293T細胞中。熒光顯徼鏡觀察到NIH293T細胞中發(fā)出綠色熒光，結(jié)果表明尼羅羅非魚β-actin基因啟動子能夠驅(qū)動EGFP的表達，證實在真核細胞水平尼羅羅非魚β-actin基因啟動子具有較好的表達活性。
　　 從尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)腦垂體中分離其總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)

4、錄合成為第一條cDNA鏈，再以第一條cDNA為模板，經(jīng)過RT-PCR，克隆得到全長785bp的生長激素基因，序列分析表明：GH開放閱讀框為615bp，共編碼204個氨基酸；其中含有17個氨基酸的信號肽和187個氨基酸的成熟GH序列。同時我們將其插入到載體啟動子下游，與增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)報告基因融合，重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序進行鑒定。通

5、過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染分別將pEGFP-GH重組表達載體、pEGFP-N1轉(zhuǎn)到293T細胞中，以檢測尼羅羅非魚GH基因表達的活性。結(jié)果顯示，陽性對照組pEGFP-N1，有熒光表達的細胞占90％以上；pEGFP-GH可見綠色熒光，但是有熒光表達的細胞較少，強度較弱。上述實驗現(xiàn)象表明，所獲得的尼羅羅非魚GH基因具有較好的表達活性，能夠在真核細胞中表達。
　　 本研究成功獲得了尼羅羅非魚β-actin基因啟動子和GH基因，同時通過細胞轉(zhuǎn)染首次在

6、真核細胞中有力的證實了其具有一定的生物活性；為進一步驗證尼羅羅非魚β-actin基因啟動子和GH基因的生物活性，本試驗還嘗試將其轉(zhuǎn)染到不同的真核細胞中，如Vero細胞（非洲綠猴腎細胞），仍然能夠觀察到有熒光發(fā)出，但強度要比在293T細胞中弱，這可能與細胞的特性有關(guān)?？傊?，本試驗成功獲得了有生物活性的尼羅羅非魚β-actin基因啟動子和GH基因，為將來進行轉(zhuǎn)基因尼羅羅非魚研究提供了兩個重要的元件。
　　 此外，本人還對太湖鰱魚mt