小鼠腎近曲小管上皮細胞頂側膜鉀通道的電生理學特性及環(huán)孢素A的影響.pdf

1、腎臟近曲小管鉀離子通道在維持細胞膜電位、調節(jié)細胞體積以及維持水與電解質的重吸收和分泌等方面，均起著非常關鍵的作用，而且近曲小管是缺氧和中毒損傷最易發(fā)生的部位，因此，對腎臟近曲小管鉀離子通道的研究具有較重要的生理學意義，目前尚未完全了解其生理學特性和功能。 環(huán)孢素A是臨床器官移植中廣泛使用的免疫抑制劑，但其嚴重的腎毒性限制了它的使用。其發(fā)病機制尚未完全明了，目前研究發(fā)現(xiàn)它不僅可引起血液動力學的改變，而且對腎小管有直接的損害作用，且

2、與近曲小管密切相關。但對于近曲小管離子通道的改變研究涉及甚少。為此，本實驗建立正常小鼠腎臟近曲小管上皮細胞原代培養(yǎng)體系，采用細胞貼附式、內面向外式膜片鉗技術研究正常小鼠腎臟近曲小管上皮細胞頂側膜K+通道的電生理學特性，觀察免疫抑制劑環(huán)孢素A對K+通道特性的影響，探討其可能的作用機制。 方法： 采取改良的膠原酶消化-密度梯度離心法進行小鼠腎臟近曲小管上皮細胞的分離及純化，獲得的近曲小管上皮細胞在DMEM培養(yǎng)基中進行單層培養(yǎng)

3、。通過臺盼藍排斥法鑒定細胞活性；光鏡、堿性磷酸酶染色觀察細胞形態(tài)學改變；透射電鏡觀察其超微結構。 在原代培養(yǎng)的細胞和經環(huán)孢素A預處理(終濃度300ng/m1)的培養(yǎng)細胞上采用細胞貼附式、內面向外式膜片鉗技術記錄近曲小管頂側膜K+通道電流進行分析比較。 主要結果： 1.采用改良的膠原酶消化-密度梯度離心法獲得的細胞大小一致，活性＞95％；光鏡下可見未貼壁細胞為圓形，胞體光滑，折光性好，直徑約8.5～10.5μm；貼

4、壁細胞呈梭形，透明度增大而折光性減弱，融合的單層細胞呈鵝卵石樣鋪滿瓶底；堿性磷酸酶染色呈陽性；電鏡檢查見面向液層的刷狀緣有微絨毛形成，細胞內可見豐富的線粒體、溶酶體。 2.小鼠腎近曲小管上皮細胞頂側膜上的這種K+通道在多數(shù)膜片(61％)中自發(fā)性開放，無自發(fā)性開放的通道在牽張時可被激活。使用含有TTX、Cd2+的浴液S2灌流時仍能記錄到這種通道。該通道表現(xiàn)為單一的電流幅度，在超極化狀態(tài)下表現(xiàn)為內向電流，其斜率電導為25.5±0.4

5、pS(鉗制電壓在20mV～60mV，n=8)，通道開放活動隨極化程度的增大而增加。在去極化狀態(tài)下表現(xiàn)為外向電流，并具有內向整流特性，其外向電流的弦電導為9.25±0.6pS(鉗制電壓在-40mV到-60mV,n=6)；在對稱性鉀浴液中該通道的翻轉電位是4.2±1.3mV，內面向外式兩側不對稱溶液(70mMbath/140mMpipette)時翻轉電位在-15.1±3.5mV，Pk/PNa≈8∶1；該通道具有一個開放時間常數(shù)和兩個關閉時間

6、常數(shù)；開放概率與鉗制電壓依賴性不明顯；通道的活動受細胞外液pH值的影響，隨著細胞外液酸性增加(pH7.4～6.8)開放概率減小。 3.經CsA處理后記錄到的K+通道電流幅度較之相同鉗制電壓下的正常通道差異不明顯，其通道的Ⅰ-Ⅴ關系并沒有因CsA處理的作用而發(fā)生位移或改變，但開放概率明顯降低，且差異顯著。 結論： 1.采用改良的膠原酶消化-密度梯度離心法分離的細胞建立的原代培養(yǎng)方法純化度高，性質可靠。 2.