高糖誘導Bim蛋白高表達而促腎近曲小管上皮細胞凋亡的機制探討.pdf

1、目的：
　　擬以人腎近曲小管上皮細胞(human proximal tubular epithelialcells，HK-2細胞)為對象，研究高糖環(huán)境下Bim與HK-2細胞凋亡的關系，并在此基礎上，進一步研究自噬在其中所起的作用。
　　方法：
　　1.第一步
　　用不同糖濃度處理HK-2細胞，檢測其中Bim蛋白的表達情況，及細胞凋亡和自噬的情況。
　　1.1.細胞分組及培養(yǎng)
　　將HK-2細胞系分為兩

2、組:NG組即正常糖對照組（5.5mmol/L D-無水葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇）和HG組即高糖試驗組（30.0mmol/L D-無水葡萄糖）。在1640培養(yǎng)基、37℃及含5％CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，擬設0h、24h、48h這三個檢測時間點。
　　1.2.檢測Bim mRNA及蛋白表達
　　利用RT-PCR法檢測Bim mRNA表達、Western Blot法檢測Bim蛋白表達。
　　1.3.檢測細胞凋亡的情況<

3、br>　　利用TUNEL法檢測細胞凋亡的比例;利用Western Blot法檢測active-caspase3蛋白表達，以間接反映細胞凋亡的情況。
　　1.4.檢測細胞自噬的情況
　　利用Western Blot法檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，反映細胞自噬的情況。
　　2.第二步
　　用轉染Bim siRNA的方式下調Bim蛋白表達，用轉染過表達質粒的方式上調Bim蛋白表達，在此基礎上分析HK-2細胞凋亡、自

4、噬的情況。
　　2.1.細胞培養(yǎng)及分組
　　NG組和HG組的HK-2細胞分別分為以下四組:siNC組（轉染無意義siRNA）、sibim組（轉染Bim siRNA）、sibim+質粒組（轉染Bim siRNA和siRNA-resistant質粒）、質粒組（轉染Bim過表達質粒）。
　　2.2.檢測Bim蛋白表達
　　利用Western Blot法檢測Bim蛋白表達。
　　2.3.檢測細胞凋亡的情況
　

5、　利用TUNEL法檢測細胞凋亡比例;利用Western Blot法檢測active-caspase3蛋白表達，間接反映細胞凋亡的情況。
　　2.4.檢測細胞自噬的情況
　　利用Western Blot法檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，反映細胞自噬的情況。
　　3.第三步
　　在用Bim siRNA抑制Bim蛋白表達的前提下，下調自噬活性，分析HK-2細胞凋亡的情況。
　　3.1.細胞培養(yǎng)及分組
　　

6、將HG組中的sibim亞組HK-2細胞分為兩組:對照組即DMSO組(只加入3-MA的溶媒DMSO)和試驗組即3-MA組（加入3-MA）。
　　3.2.檢測細胞凋亡的情況
　　利用TUNEL法檢測細胞凋亡比例;利用Western Blot法檢測active-caspase3蛋白表達，間接反映細胞凋亡的情況。
　　4.統計學處理采用SPSS18.0統計軟件處理數據。兩組數據的比較應用學生t檢驗(student's t te

7、st)。多組間的比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)。數據采用mean±SEM表示，檢驗標準α=0.05，P＜0.05時認為有統計學意義。
　　結果：
　　1.高濃度葡萄糖組HK-2細胞凋亡和Bim蛋白表達增加對照組HK-2細胞不管是24小時還是48小時，其TUNEL染色陽性的細胞均微乎其微;而高糖組，其TUNEL染色陽性的細胞比例比對照組明顯增多，而且隨高糖培養(yǎng)時間的延長，凋亡細胞增多的趨勢越來越明顯。應用單

8、因素方差分析的方法(One-way ANOVA)進行統計學分析，可以發(fā)現高糖組24小時的細胞凋亡率與對照組同時間的細胞凋亡率比較或是與同濃度0時的細胞凋亡率比較，均有顯著性差異，其P值均＜0.05;而高糖組48小時的細胞凋亡率與對照組同時間的細胞凋亡率比較或是與同濃度0時的細胞凋亡率比較，也有顯著性差異，其P值分別＜0.05和＜0.01。用western blot方法檢測active-Caspase3蛋白的表達量也可以發(fā)現相同的規(guī)律。<

9、br>　　高糖培養(yǎng)組HK-2細胞隨著時間的延長，其BimEL蛋白的表達逐漸升高;而對照組24小時、48小時均未見BimEL蛋白的表達的增加。Bim蛋白的另一種主要異構體BimL的表達量也隨著高糖培養(yǎng)的時間逐漸增加。用單因素方差分析處理數據統顯示:高糖培養(yǎng)24小時HK-2細胞BimEL蛋白的表達較同等培養(yǎng)時間的對照組顯著增加(P＜0.05)，較高糖刺激前顯著增加(P＜0.05);HK-2細胞經高糖培養(yǎng)48小時其BimEL蛋白的表達較同等培

10、養(yǎng)時間的對照組顯著增加(P＜0.01)，較高糖培養(yǎng)前顯著增加(P＜0.01)。
　　高糖培養(yǎng)下HK-2細胞Bim mRNA的水平明顯增加。高糖培養(yǎng)24小時Bim mRNA相對水平較高糖培養(yǎng)前和相同時間點的對照組均顯著增加（P值均＜0.01），高糖培養(yǎng)48小時Bim mRNA相對水平也較高糖培養(yǎng)前和相同時間點的對照組顯著增加（P值均＜0.01）。
　　用western blot法檢測LC3蛋白的兩種形式LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ及

11、其比值（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）。發(fā)現不管是高糖組還是對照組，培養(yǎng)24小時還是48小時，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均較低，也就是說細胞的自噬始終處于一個較低的水平，高糖組的自噬較對照組并沒有見到明顯的改變。
　　2.Bim蛋白對HK-2細胞凋亡和自噬的影響
　　和無意義siRNA組（siNC組）組對比，有效的siRNA的轉染(siBim組)將內源性Bim蛋白抑制到了原有水平的21％。在同樣高糖培養(yǎng)48小時的條件下，下調Bim

12、組（siRNA組）的HK-2細胞的凋亡比例沒有增加;而siNC組細胞凋亡的比例明顯增加。我們應用了siRNA-resistant Bim(Bim-res)質粒與siRNA共轉染來排除脫靶現象。siBim組高糖培養(yǎng)后下降的凋亡細胞的比例，在給予Bim-res質粒后又恢復了，siBim加Bim-res組比siBim組凋亡細胞的比例顯著增加(P＜0.05)。
　　我們將正常糖對照的HK-2細胞分成兩個小組，一組正常培養(yǎng)（對照組），一組轉

13、染BimEL蛋白過表達質粒，培養(yǎng)48小時后，用TUNEL法檢測細胞凋亡情況，發(fā)現過表達質粒組細胞較對照組凋亡細胞的比例明顯增加。
　　我們在正常葡糖濃度培養(yǎng)的HK-2細胞中用siRNA下調Bim，培養(yǎng)48小時，可見LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高，由1.0上升到了2.0，而用拮抗siRNA的Bim-res質粒與siRNA共轉染后，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值又下降到了1.1。在30mmol/L葡萄糖組，用siRNA下調HK-2細胞

14、Bim，培養(yǎng)48小時，可見0時、24小時、48小時LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分別是:1.0、2.2、3.0，意味著下調Bim后，隨著時間的延長，細胞的自噬程度逐漸增強;而將Bim-res質粒與siRNA共轉染后，0時、48小時LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分別是:1.0、1.3，表明去除下調Bim的因素后，48小時的高糖培養(yǎng)，細胞自噬程度并沒有明顯的改變。
　　3.抑制自噬增加了HK-2細胞的凋亡
　　我們將轉染了針對于Bim的

15、siRNA的HK-2細胞，培養(yǎng)2天后，再給予高糖（30mmol/L葡萄糖）培養(yǎng)，然后分成兩組:試驗組（3-MA組）加用自噬抑制劑3-MA;對照組（DMSO組）只給予3-MA的溶媒二甲基亞砜(DMSO)。我們可以看到，試驗組與對照組相比，不管是24小時還是48小時，細胞凋亡比例均明顯增加（用TUNEL法檢測）;Western Blot法檢測active-caspase3表達也可以發(fā)現同樣的規(guī)律。
　　結論：
　　1.我們的研究

16、首次通過體外細胞實驗發(fā)現高濃度葡萄糖可以引起腎近曲小管上皮細胞凋亡增加，而且隨著高糖培養(yǎng)的時間的延長，細胞凋亡逐漸增多。
　　2.高糖通過上調Bim蛋白的表達，從而促進腎近曲小管細胞凋亡的，而Bim蛋白上調伴隨著基因轉錄水平的上調。
　　3.細胞基礎狀態(tài)下的自噬水平較低。高糖誘導Bim蛋白表達增加從而引起腎小管上皮細胞凋亡增加的機制與細胞自噬程度的改變關系不大，有可能是Bim通過Bax/Bak介導線粒體途徑的細胞凋亡。

17、>　　4.通過下調Bim，HK-2細胞能夠恢復被Bim抑制的自噬，從而發(fā)揮自噬對細胞的保護作用。也就是說，下調Bim蛋白的表達，除了直接影響凋亡途徑外，還能增加細胞自噬，從而抑制細胞凋亡。
　　5.抑制自噬本身可以增加細胞凋亡，此時Bim已被siRNA下調，所以這個過程是不依賴于Bim蛋白的。
　　主要創(chuàng)新點：
　　1.我們的研究首次證明了高濃度葡萄糖可以通過上調Bim蛋白表達從而引起腎小管上皮細胞凋亡增加，并且隨著高