火雞組織滴蟲體外分離培養(yǎng)體系和動物感染模型的建立及中藥體外抑制研究.pdf

1、禽組織滴蟲病(Histomoniasis)又稱為傳染性盲腸肝炎或“黑頭病”，是由火雞組織滴蟲（Histomonas meleagridis）引起的雞形目禽類的一種原生寄生蟲病，以肝臟壞死、盲腸腫大和排硫磺樣糞便為主要特征，在火雞中尤為嚴重，可引起嚴重的經(jīng)濟損失。目前，由于能夠有效治療和預(yù)防該病的化學(xué)藥物具有潛在的致癌性而大多被禁止使用，導(dǎo)致該病近年發(fā)生大規(guī)模傳播和流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的危害。近年來，隨著國內(nèi)規(guī)?；鷳B(tài)圈養(yǎng)和放養(yǎng)等健康

2、養(yǎng)殖技術(shù)的示范和推廣，組織滴蟲病在我國的流行和發(fā)生也越來越嚴重，而國內(nèi)對相關(guān)研究并不多且不系統(tǒng)，因此，開展對火雞組織滴蟲及組織滴蟲病的研究，研究該病的發(fā)病機制、藥物防治及疫苗對于養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。本研究首先對江蘇地區(qū)的火雞組織滴蟲進行了分離，成功建立了火雞組織滴蟲體外分離培養(yǎng)的體系，并對該體系進行了優(yōu)化;其次對分離的火雞組織滴蟲蟲體進行單克隆培養(yǎng)并對純化的蟲株進行了凍存和復(fù)蘇;用單克隆培養(yǎng)的蟲體成功建立了動物感染模型;在體外

3、研究了中藥產(chǎn)品對火雞組織滴蟲的抑制作用。
　　1.火雞組織滴蟲體外培養(yǎng)方法的建立
　　為了研究火雞組織滴蟲的生物學(xué)特性，建立一種簡單有效的火雞組織滴蟲體外培養(yǎng)方法非常重要。火雞組織滴蟲感染的主要器官是盲腸和肝臟，是一種非常脆弱的微生物，在臟器中和環(huán)境溫度中裸露的蟲體一旦隨著糞便排出體外，只能夠存活很短的時間，所以火雞組織滴蟲的體外分離非常困難。本研究采用M199培養(yǎng)基可作為火雞組織滴蟲體外培養(yǎng)的營養(yǎng)培養(yǎng)基，再加入胎牛血清或者

4、滅活馬血清以及米粉等組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別從盲腸和肝臟中分離蟲體。將臨床上剪碎的肝臟組織或盲腸內(nèi)容物接種培養(yǎng)48 h后，首先對培養(yǎng)產(chǎn)物進行形態(tài)學(xué)判定，再經(jīng)PCR鑒定。研究結(jié)果表明，用盲腸內(nèi)容物分離培養(yǎng)時得到3種盲腸寄生原蟲:火雞組織滴蟲，芽囊原蟲和雞四毛滴蟲，三者混合感染，難以獲得單一種類蟲體;從肝臟中分離時能獲得單一種類的火雞組織滴蟲蟲體，火雞組織滴蟲的體外分離培養(yǎng)宜從帶有病變的新鮮肝臟組織中進行。
　　2.火雞組織滴蟲體外培養(yǎng)體

5、系的優(yōu)化
　　火雞組織滴蟲培養(yǎng)基包含M199培養(yǎng)基、米粉、滅活馬血清及盲腸細菌，為建立最優(yōu)的培養(yǎng)體系，本研究對培養(yǎng)條件及培養(yǎng)液的組成進行了系列優(yōu)化。在40℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)2-3天后火雞組織滴蟲的群體數(shù)量將會達到5×105個/ml，隨后便會開始快速減少。實驗過程中改變每9 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中米粉的量0 mg,10 mg、20 mg、40 mg,60 mg,80 mg,100 mg;血清的種類:胎牛血清與滅活馬血清;血清比例0、5

6、％、10％、15％、20％、30％、40％;以及有氧與無氧培養(yǎng)條件的比較。再利用新鮮的病變肝臟組織進行火雞組織滴蟲分離培養(yǎng)，比較有盲腸細菌和無盲腸細菌的差別，最終獲得了火雞組織滴蟲的最佳體外培養(yǎng)體系?；痣u組織滴蟲在9 ml含90％ M199培養(yǎng)基，10％滅活馬血清，10 mg米粉及含盲腸細菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長良好，可培養(yǎng)獲得穩(wěn)定和高產(chǎn)量的火雞組織滴蟲蟲體。
　　3.火雞組織滴蟲的體外單克隆及保存復(fù)蘇
　　采用體外分離培養(yǎng)技術(shù)

7、對江蘇地區(qū)采集的兩例典型病變的新鮮肝臟組織中火雞組織滴蟲進行了體外分離培養(yǎng)，獲得了兩個不同地區(qū)火雞組織滴蟲的蟲體。進一步參照球蟲單卵囊分離技術(shù)中的懸液法對火雞組織滴蟲進行了單克隆純化，獲得兩株火雞組織滴蟲，分別命名為JSYZ-A和JSYZ-B。然后將擴大培養(yǎng)的單克隆蟲株放入液氮中長期凍存，并且對凍存的蟲株成功進行了復(fù)蘇。研究結(jié)果表明，建立的火雞組織滴蟲體外單克隆培養(yǎng)、凍存及復(fù)蘇的方法切實可行，為開展蟲體的病原學(xué)、致病機理以及燕窩和疫苗的

8、研制奠定了很好的基礎(chǔ)。
　　4.火雞組織滴蟲體外動物感染模型的建立
　　采用單克隆培養(yǎng)的火雞組織滴蟲JSYZ-A感染了SPF黃羽雞。研究了不同感染劑量、不同感染途徑對火雞組織滴蟲體外感染動物模型的影響。實驗中用JSYZ-A蟲株以104、105和106個蟲體經(jīng)口感染3組15日齡的黃羽雞;再經(jīng)泄殖腔以104、105和106個蟲體感染3組15日齡的黃羽雞;并設(shè)對照組，每組10只雞。感染15天后實驗結(jié)束，對雞的死亡率、平均增重、盲腸

9、和肝臟的損傷等進行統(tǒng)計分析，評價人工感染的效果。研究結(jié)果表明，黃羽雞經(jīng)泄殖腔感染105個蟲體時就可以成功建立火雞組織滴蟲的體外感染動物模型。
　　5.不同中草藥對火雞組織滴蟲體外抑制效果的研究
　　出于食品安全方面的考慮，能夠有效預(yù)防和治療禽組織滴蟲病的化學(xué)藥物都被禁止使用，這使得禽組織滴蟲病在禽養(yǎng)殖業(yè)中大量爆發(fā)，帶來了重大經(jīng)濟損失，迫切需要尋找一種能夠替代化學(xué)藥物且能有效控制禽組織滴蟲病的藥物。本實驗比較了白頭翁、金蓮花、

10、雞冠花、荊芥、常山、香薷、花椒、駱駝蓬、苦參、千里光、大蒜素、青蒿素、蛇床子素13種中草藥及提取物在體外對火雞組織滴蟲的抑制作用。將藥物加入到預(yù)準備M199基礎(chǔ)培養(yǎng)基中后，然后再接種火雞組織滴蟲進行培養(yǎng)，在不同培養(yǎng)時間觀察計數(shù)蟲體的生長繁殖狀況，得到藥物對體外培養(yǎng)的火雞組織滴蟲的抑制效果，所選白頭翁、金蓮花、雞冠花等10種中草藥在體外對火雞組織滴蟲有較好的抑制作用，其中以金蓮花、常山和駱駝蓬的抑制作用最好;大蒜素、青蒿素等3種中草藥提取