2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、探索海洋貝類細(xì)胞培養(yǎng)體系建立方法的研究是一項(xiàng)意義重大且負(fù)有挑戰(zhàn)的課題。一方面體外細(xì)胞培養(yǎng)體系是闡明養(yǎng)殖病原微生物致病機(jī)制、細(xì)胞分子育種、功能基因的深入研究等諸多科研領(lǐng)域急需的實(shí)驗(yàn)工具;另一方面,目前在世界范圍內(nèi),尚未建立針對(duì)海洋貝類生物細(xì)胞培養(yǎng)的成熟方法。本研究旨在建立一種適用于海洋貝類的細(xì)胞培養(yǎng)方法,提高貝類細(xì)胞培養(yǎng)體系的研究應(yīng)用能力。
  本文以中國北方重要的經(jīng)濟(jì)貝類櫛孔扇貝為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,選取多種細(xì)胞類型進(jìn)行體外培養(yǎng)體系建立的研

2、究。以優(yōu)化培養(yǎng)條件的傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ),通過添加因子和外源基因?qū)氲仁侄握T導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,建立了櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲和成體組織細(xì)胞體外培養(yǎng)體系;進(jìn)一步對(duì)櫛孔扇貝幼蟲體外傳代培養(yǎng)細(xì)胞的特性和功能進(jìn)行了初步分析。主要結(jié)果如下:
  本文通過優(yōu)化細(xì)胞解離方法、向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)因子等,有效地促進(jìn)和維持了體外培養(yǎng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞的增殖能力和長(zhǎng)期存活,成功地實(shí)現(xiàn)了幼蟲細(xì)胞在體外傳代培養(yǎng)19代。研究發(fā)現(xiàn):使用無鈣海水配以機(jī)械法獲得的解離細(xì)胞活力明

3、顯高于使用膠原酶和胰酶酶解獲得的細(xì)胞;添加適宜濃度的胎牛血清可提高細(xì)胞的有絲分裂能力和貼壁能力;添加適宜濃度的櫛孔扇貝血清可提高體外培養(yǎng)細(xì)胞的貼壁能力和維持細(xì)胞形態(tài);添加適宜濃度的卵黃提取液可促進(jìn)傳代培養(yǎng)后期細(xì)胞的增殖和貼壁能力; EGF和bFGF生長(zhǎng)因子組合的添加可有效延長(zhǎng)細(xì)胞壽命并維持細(xì)胞形態(tài)。擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中主要包括3類細(xì)胞,分別是圓形透亮細(xì)胞、圓形顆粒大細(xì)胞和圓形黑色小細(xì)胞;其中圓形透亮細(xì)胞具有最佳的生理狀態(tài),如在Pe

4、rco ll分離后體系中,該種類細(xì)胞于12 h后即可貼壁且分裂速度較快。但整體而言,3類細(xì)胞的增殖能力和貼壁能力均隨體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢(shì)。進(jìn)一步,通過櫛孔扇貝ITS序列擴(kuò)增鑒定所獲體外傳代培養(yǎng)物屬于櫛孔扇貝細(xì)胞。
  使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲原代、第12代和第18代體系中S期細(xì)胞的比例,顯示隨著體外培養(yǎng)細(xì)胞傳代次數(shù)的增加,S期細(xì)胞所占的比例逐漸降低;采用原位雜交技術(shù)比較了櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)原代細(xì)胞

5、和傳代細(xì)胞中piwi(參與維持細(xì)胞的自我更新特征)和phb2(細(xì)胞周期中抑制G1期向S期的過度)基因的表達(dá),結(jié)果顯示:櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲原代和傳代培養(yǎng)體系中的3類細(xì)胞均可表達(dá)piwi和phb2基因;其中piwi基因在原代培養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)中的陽性信號(hào)較第16代細(xì)胞的致密;phb2基因在第16代細(xì)胞中的表達(dá)明顯強(qiáng)于原代細(xì)胞;呈現(xiàn)出隨培養(yǎng)代數(shù)增多細(xì)胞的增殖能力逐漸衰退。
  采用免疫組織化學(xué)技術(shù)揭示了體外培養(yǎng)細(xì)胞肌凝蛋白(細(xì)肌絲成分),5羥色

6、胺(神經(jīng)遞質(zhì)成分),肌動(dòng)蛋白和微管蛋白(細(xì)肌絲或細(xì)胞骨架成分)等的表達(dá),發(fā)現(xiàn)櫛孔扇貝幼蟲細(xì)胞體外培養(yǎng)至16代時(shí),細(xì)胞中肌凝蛋白的表達(dá)較原代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)期更加顯著,暗示該時(shí)期細(xì)胞有向肌細(xì)胞分化的趨勢(shì),但其分化時(shí)間較正常發(fā)育的擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞晚。本次我們未在體外培養(yǎng)的幼蟲細(xì)胞中檢測(cè)到神經(jīng)遞質(zhì)5羥色胺的表達(dá),與正常發(fā)育的中后期擔(dān)輪幼蟲頭部區(qū)細(xì)胞首先檢測(cè)到兩個(gè)表達(dá)位點(diǎn)的結(jié)果不一致。
  本研究采用優(yōu)化培養(yǎng)體系的方法,建立了櫛孔扇貝血淋巴、鰓、卵

7、巢、精巢、心臟等成體組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)體系,各種組織細(xì)胞均可在體外存活2.5周以上;進(jìn)一步,嘗試了脂質(zhì)體(Lipo2000)、陽離子聚合物(PEI)和慢病毒介導(dǎo)外源基因SV40LT(猿猴病毒大T抗原基因)誘導(dǎo)體外原代培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,其中慢病毒感染法對(duì)細(xì)胞傷害最小,轉(zhuǎn)染效率最高可達(dá)到25%,能夠使轉(zhuǎn)基因后的貝類體外培養(yǎng)細(xì)胞的平均存活壽命顯著延長(zhǎng),并在病毒感染后的心臟細(xì)胞培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂相。
  綜上,本研究所建立的扇貝幼蟲體外

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