小鼠精原細胞分離及體外分化培養(yǎng)的研究.pdf

1、 小鼠精原細胞分離及體外分化培養(yǎng)的研究摘 要哺乳動物生殖細胞的 分化是保持物 種延續(xù) 不可缺少的 方式。 精原細胞， 特別是其中的 精原干 細胞是產(chǎn)生精子的 源泉， 通過體外培養(yǎng)精原細胞獲 得成熟的精子， 對 于保護瀕臨滅 絕的 物種遺傳資源具 有重 要理論和現(xiàn)實意義. 另外， 精原 干細胞還可以進 行體外冷凍保 存、 遺傳操作 和移植，因 而它對于醫(yī)學(xué)研究、 生物學(xué)實驗和生 物技術(shù)的研究 具有重要的價值。試驗采用

2、物理和化學(xué)方法相 結(jié)合， 對小鼠 的辜丸 支持細胞、 辜丸間 質(zhì)細胞和 精原 細胞進行分離、 純化， 并進行傳代 培養(yǎng)和染色鑒 定，觀察其形 態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué) 特性。 通過添加不同 的營養(yǎng)因 子或與翠丸支持 細胞、 辜丸間 質(zhì)細胞和精原細胞共 培養(yǎng)， 對影響精 原干細胞分化的一些因素進行了初步探討， 為進一步建立精原干細胞的體外分化培養(yǎng)體系奠定了基礎(chǔ)。本研究主要獲得了以下結(jié)果。1 .選擇 1 6 一2d的 雄性昆明小白鼠 ，經(jīng)過膠原酶和胰

3、蛋白酶分步消化， 0 . 0 5MT r is 一 H c L低滲處 理后， 平均每個肇丸可獲 得 2 xl 0 6 個肇丸支 持細胞，細胞的 純度可 達8 9 . 8 7 % ，活細胞數(shù)占總 細胞數(shù)的 9 5. 巧 %。辜丸 支持細胞的貼壁性狀良 好， 在培養(yǎng)至第Z d 時進入對 數(shù)生長期，細胞 增殖旺盛， 至第6 d時進入平臺期， 增殖速度開 始減慢， 但培養(yǎng)到第7 d 仍未見有調(diào)亡的細胞出現(xiàn) 。2 .選擇6 周齡左右的雄性昆明小白

4、鼠，經(jīng)過膠原酶和胰蛋白酶限時消化， P eo U密度梯度離 心后， 獲得的攀丸間 質(zhì)細胞能 夠維持正常的生長 特性， 活 細胞率 較辜丸 支持細胞有所降低， 平均達8 5， 0 2 %。3 .選擇7 ~ s d 的雄性昆 明小白鼠， 經(jīng)過膠原酶和胰蛋白 酶限時消化，P ~ 1 密度梯度離心后，精原 細胞主要分布于2 7 0 / o t3 5% 的P e r co l l 梯度間。再利 用選擇性貼壁 法，結(jié)果獲得的精原細胞的純度達6 2.

5、 5 0 %， 但是， 單獨培養(yǎng)小鼠的辜丸精原細胞至第3 d 時，細胞即開始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。4 . 在單獨培養(yǎng)的精原 細胞的培養(yǎng)液中分別 添加促卵 泡激素 ( FS H ) 和皋 酮， F S H 對辜丸精原 細胞的分化無顯著的 促進作用， 辜酮對精原細胞的 體外分化培養(yǎng) 有一定的促 進作 用。 在培養(yǎng)液中 添加成年鼠 的 翠丸 提取液， 結(jié)果發(fā) 現(xiàn)， 皋丸 液對精原的 細胞的體外 分化有顯著的 促進作用。 辜丸支持 細胞、 辜丸間 質(zhì)細

6、胞與精原 細胞共培養(yǎng)， 也能 促進肇丸精原細胞的分化，但效果不如辜丸液顯著。另外，不同的消化傳代方法，對精原細胞的增殖分化和傳代數(shù)影響也不同。關(guān)鍵詞:精原 細胞: 辜丸支持細胞;辜丸 間質(zhì)細胞: 分離: 分化培養(yǎng)d i f e鄺 n t i a t io n o f s p er ma t o g 耐a i n v i t r o c ul t U re · T o a d d t e s t ic l e l i 明i d

7、f r oma d u h m ou s et oc e l lm e di u m ，i t w a s s i g ni f i c a n t l y P r O m o t e d d i f er e n t i a t i o n o fs p e n ” a t o g o n l ai nv i t r o . C o 一 c u l t u r e o f s e r t o l i c e l l s ， 1 盯 d

8、 i g c e l l s a n ds p e r ma t o g o n i a a l s oc ou l d s i m u 1 a t e t h ed i f er e n t i a t io n o f s P e n 力 a t o g on i a ，b u tt h e e f eC t w a s l o w e r t h a nt e s t i c l e l i q ui d . A dd i t i

9、 o n a ll y ，t h e e f ec t s o f v a r ie d m e t h 0 d o f d i g e s t i 0 n a n d P a s s a g e o n P r o 1 i f e r a t 1 o n ，d i f er e n t i a t i o n a ndP a s s a g e c o u n t o f S Pe n n a t O g o n i a w e r