小鼠精原細(xì)胞分離及體外分化培養(yǎng)的研究.pdf

1、 小鼠精原細(xì)胞分離及體外分化培養(yǎng)的研究摘 要哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞的 分化是保持物 種延續(xù) 不可缺少的 方式。 精原細(xì)胞， 特別是其中的 精原干 細(xì)胞是產(chǎn)生精子的 源泉， 通過體外培養(yǎng)精原細(xì)胞獲 得成熟的精子， 對(duì) 于保護(hù)瀕臨滅 絕的 物種遺傳資源具 有重 要理論和現(xiàn)實(shí)意義. 另外， 精原 干細(xì)胞還可以進(jìn) 行體外冷凍保 存、 遺傳操作 和移植，因 而它對(duì)于醫(yī)學(xué)研究、 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和生 物技術(shù)的研究 具有重要的價(jià)值。試驗(yàn)采用

2、物理和化學(xué)方法相 結(jié)合， 對(duì)小鼠 的辜丸 支持細(xì)胞、 辜丸間 質(zhì)細(xì)胞和 精原 細(xì)胞進(jìn)行分離、 純化， 并進(jìn)行傳代 培養(yǎng)和染色鑒 定，觀察其形 態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué) 特性。 通過添加不同 的營養(yǎng)因 子或與翠丸支持 細(xì)胞、 辜丸間 質(zhì)細(xì)胞和精原細(xì)胞共 培養(yǎng)， 對(duì)影響精 原干細(xì)胞分化的一些因素進(jìn)行了初步探討， 為進(jìn)一步建立精原干細(xì)胞的體外分化培養(yǎng)體系奠定了基礎(chǔ)。本研究主要獲得了以下結(jié)果。1 .選擇 1 6 一2d的 雄性昆明小白鼠 ，經(jīng)過膠原酶和胰

3、蛋白酶分步消化， 0 . 0 5MT r is 一 H c L低滲處 理后， 平均每個(gè)肇丸可獲 得 2 xl 0 6 個(gè)肇丸支 持細(xì)胞，細(xì)胞的 純度可 達(dá)8 9 . 8 7 % ，活細(xì)胞數(shù)占總 細(xì)胞數(shù)的 9 5. 巧 %。辜丸 支持細(xì)胞的貼壁性狀良 好， 在培養(yǎng)至第Z d 時(shí)進(jìn)入對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞 增殖旺盛， 至第6 d時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期， 增殖速度開 始減慢， 但培養(yǎng)到第7 d 仍未見有調(diào)亡的細(xì)胞出現(xiàn) 。2 .選擇6 周齡左右的雄性昆明小白

4、鼠，經(jīng)過膠原酶和胰蛋白酶限時(shí)消化， P eo U密度梯度離 心后， 獲得的攀丸間 質(zhì)細(xì)胞能 夠維持正常的生長(zhǎng) 特性， 活 細(xì)胞率 較辜丸 支持細(xì)胞有所降低， 平均達(dá)8 5， 0 2 %。3 .選擇7 ~ s d 的雄性昆 明小白鼠， 經(jīng)過膠原酶和胰蛋白 酶限時(shí)消化，P ~ 1 密度梯度離心后，精原 細(xì)胞主要分布于2 7 0 / o t3 5% 的P e r co l l 梯度間。再利 用選擇性貼壁 法，結(jié)果獲得的精原細(xì)胞的純度達(dá)6 2.

5、 5 0 %， 但是， 單獨(dú)培養(yǎng)小鼠的辜丸精原細(xì)胞至第3 d 時(shí)，細(xì)胞即開始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。4 . 在單獨(dú)培養(yǎng)的精原 細(xì)胞的培養(yǎng)液中分別 添加促卵 泡激素 ( FS H ) 和皋 酮， F S H 對(duì)辜丸精原 細(xì)胞的分化無顯著的 促進(jìn)作用， 辜酮對(duì)精原細(xì)胞的 體外分化培養(yǎng) 有一定的促 進(jìn)作 用。 在培養(yǎng)液中 添加成年鼠 的 翠丸 提取液， 結(jié)果發(fā) 現(xiàn)， 皋丸 液對(duì)精原的 細(xì)胞的體外 分化有顯著的 促進(jìn)作用。 辜丸支持 細(xì)胞、 辜丸間 質(zhì)細(xì)

6、胞與精原 細(xì)胞共培養(yǎng)， 也能 促進(jìn)肇丸精原細(xì)胞的分化，但效果不如辜丸液顯著。另外，不同的消化傳代方法，對(duì)精原細(xì)胞的增殖分化和傳代數(shù)影響也不同。關(guān)鍵詞:精原 細(xì)胞: 辜丸支持細(xì)胞;辜丸 間質(zhì)細(xì)胞: 分離: 分化培養(yǎng)d i f e鄺 n t i a t io n o f s p er ma t o g 耐a i n v i t r o c ul t U re · T o a d d t e s t ic l e l i 明i d

7、f r oma d u h m ou s et oc e l lm e di u m ，i t w a s s i g ni f i c a n t l y P r O m o t e d d i f er e n t i a t i o n o fs p e n ” a t o g o n l ai nv i t r o . C o 一 c u l t u r e o f s e r t o l i c e l l s ， 1 盯 d

8、 i g c e l l s a n ds p e r ma t o g o n i a a l s oc ou l d s i m u 1 a t e t h ed i f er e n t i a t io n o f s P e n 力 a t o g on i a ，b u tt h e e f eC t w a s l o w e r t h a nt e s t i c l e l i q ui d . A dd i t i

9、 o n a ll y ，t h e e f ec t s o f v a r ie d m e t h 0 d o f d i g e s t i 0 n a n d P a s s a g e o n P r o 1 i f e r a t 1 o n ，d i f er e n t i a t i o n a ndP a s s a g e c o u n t o f S Pe n n a t O g o n i a w e r