大鼠肝卵圓細(xì)胞增殖模型的建立和體外分離的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：肝卵圓細(xì)胞是一類(lèi)具有多向分化潛能的肝干細(xì)胞，在一定條件下可以分化成為肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、胰腺及腸型上皮細(xì)胞。卵圓細(xì)胞具有更小的免疫源性，有利于移植后的存活和增殖，從而更好的達(dá)到恢復(fù)器官功能，治愈疾病的目的。但增殖模型研究較少，體外分離方法尚不完全成熟。 本實(shí)驗(yàn)主要研究如何完善大鼠肝卵圓細(xì)胞（HOC）的增殖模型，探討有效體外分離和鑒定HOC的方法． 方法：選擇30只體重（150±10）g的雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為

2、對(duì)照組和模型組。采用2—乙酰氨基芴+2/3肝切除術(shù)的方法（2—acetylaminofluorene+two thirds panial hepatectomy，2—AAF+2/3PH）建立HOC增殖模型。模型組給予15mg/kg/d的2—AAF通過(guò)胃管灌喂，對(duì)照組灌喂等量的生理鹽水，5d后行肝2/3切除，術(shù)后第二天按術(shù)前劑量繼續(xù)灌喂，并于術(shù)后10～14d取肝組織，行CK19及C—kit免疫組化染色觀察HOC增殖情況，利用改進(jìn)的Segl

3、en膠原酶和Percoll密度梯度離心分離出大鼠HOC，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞特點(diǎn)，并對(duì)新分離的卵圓細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定。 結(jié)果：1．肝組織HE染色結(jié)果：大鼠肝組織內(nèi)可見(jiàn)明顯的肝卵圓細(xì)胞增生，細(xì)胞增生部位多位于匯管區(qū)及小葉間膽管附近。所見(jiàn)到的肝卵圓細(xì)胞體積較小，卵圓細(xì)胞核呈卵圓形，胞質(zhì)較少，嗜堿性。核/漿比例大，體積僅相當(dāng)于成體肝細(xì)胞的1/4～1/3。其中，核漿比例大，具有卵圓形細(xì)胞典型結(jié)構(gòu)特征，而細(xì)胞的外形呈卵圓形是其形態(tài)特征

4、。肝卵圓細(xì)胞大小及分布不均勻，呈簇狀分布，且由匯管區(qū)向肝實(shí)質(zhì)內(nèi)延伸。對(duì)照組大鼠肝組織內(nèi)未見(jiàn)明顯肝卵圓細(xì)胞增生。 2．肝組織免疫化學(xué)結(jié)果：免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，肝卵圓細(xì)胞胞漿CK19及C—kit染色陽(yáng)性。 3．細(xì)胞傳代培養(yǎng)及動(dòng)態(tài)觀察：分離的肝卵圓細(xì)胞大部分于24h內(nèi)即貼壁，部分肝細(xì)胞也可貼壁生長(zhǎng)，隨著換液2～3次后，可見(jiàn)肝細(xì)胞逐漸碎裂消失，而肝卵圓細(xì)胞緩慢增殖成片，約2周后鋪滿(mǎn)整個(gè)瓶底，傳第一代細(xì)胞約需2周，以后每傳一

5、代需要5～7d。相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察顯示，剛分離的肝卵圓細(xì)胞大小均勻，呈多角形，核為卵圓形或圓球形，胞漿較少。接種于培養(yǎng)瓶中1～2h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁并伸展，12h后增殖明顯活躍，細(xì)胞體積增大，形態(tài)呈不規(guī)則多邊或多角形，細(xì)胞間隙逐漸縮小，呈單層鋪磚樣結(jié)構(gòu)，顯示了上皮細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)（圖2A）。3～4d后細(xì)胞相互接觸，布滿(mǎn)視野。每2d換液1次，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后傳代，一般可傳2～4代。 4．肝卵圓細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果：免疫細(xì)胞熒光顯示我們分離培養(yǎng)的