肌萎縮側索硬化體外培養(yǎng)模型的建立.pdf

1、河北醫(yī)科大學博士學位論文肌萎縮側索硬化體外培養(yǎng)模型的建立姓名：肖向建申請學位級別：博士專業(yè)：神經病學指導教師：李春巖20050401中文摘要因此，較單運動神經元培養(yǎng)更適合研究ALS。我們分別利用腦片和脊髓片的培養(yǎng)技術，結合谷氨酸的慢性興奮毒性作用機制，制備ALS的器官型培養(yǎng)模型，并進一步探討膠質源性神經營養(yǎng)因子(GDNF)在該模型中對運動神經元的保護作用口論文共分四部分:第一部分建立大鼠運動區(qū)腦片的培養(yǎng)方法，并將培養(yǎng)的腦片與在體內生長至

2、同時期的運動皮層對比第二部分根據谷氨酸的興奮毒機制，利用谷氨酸轉運體抑制劑蘇一輕天冬氨酸(THA)制作運動皮層大錐體細胞損傷的腦片培養(yǎng)模型第三部分利用脊髓片的器官培養(yǎng)技術，用谷氨酸轉運體抑制劑蘇一輕天冬氨酸制作脊髓腹角運動神經元損傷而中間神經元不受影響的脊髓器官型培養(yǎng)模型第四部分觀察GDNF對THA介導的上、下運動神經元損傷的保護作用。第一部分大鼠腦片的培養(yǎng)及運動皮層錐體細胞的組化鑒定目的:建_t.大鼠運動區(qū)腦片的培養(yǎng)技術，應用抗非磷酸

3、化神經絲抗體(SMI32)對大腦皮層大錐體細胞進行免疫組化鑒定和計數，并比較培養(yǎng)腦片中大錐體細胞數目與同齡大鼠體內生長的大錐體細胞數目，建立穩(wěn)定的能模擬體內生長環(huán)境的腦片培養(yǎng)模型。方法:腦片的培養(yǎng)用1日齡SD大鼠，在無菌條件下快速分離、取出完整大腦，用手術刀沿正中線將其切為左右兩半，分別用McIIwain組織切片機將額頂葉切成350um厚的冠狀切片，將切片轉移到4℃的GBSS中，在解剖顯微鏡下分離成單片。從額極開始的前3片(士1.05m

4、m)棄除，從第4片開始連續(xù)取3片切片。6孔培養(yǎng)板內每孔放入1ml培養(yǎng)基ms，每孔放置1個MillicellCMinsert，用吸管將完好的腦片轉移至insert上，每個insertI放3片，移去，nsert膜表面多余的培養(yǎng)液，入C02培養(yǎng)箱(370C，5%C0295%空氣)培養(yǎng)，驚周換液2次。分別在培養(yǎng)2周、3周、4周和5周時將腦片取出，SMI32免疫組化染色，200X光鏡下對大錐體細胞計數，并測定各時間點培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)含