devR基因突變對(duì)結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞毒性的影響.pdf

1、結(jié)核病的病死率僅次于HIV的感染，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到了全人類的生存和健康。我國(guó)作為結(jié)核病負(fù)擔(dān)大國(guó)，結(jié)核分枝桿菌的耐藥問(wèn)題也日漸突出，因此研究結(jié)核分枝桿菌的耐藥和基因突變機(jī)制，對(duì)于疾病的防控意義重大。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌雙組份系統(tǒng)的 devR(反應(yīng)調(diào)節(jié)子編碼基因)在臨床耐藥菌株中出現(xiàn)不同程度的升高表達(dá)現(xiàn)象，并利用同源重組方法構(gòu)建了devR基因敲除的卡介苗菌株。本課題在前期工作基礎(chǔ)上，構(gòu)建了乙酰胺啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)devR的回補(bǔ)菌株，并通

2、過(guò)驗(yàn)證devR對(duì)巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞的毒性作用，進(jìn)一步探索了devR缺失導(dǎo)致的休眠障礙與結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞毒性的關(guān)系。
　　一、devR基因回補(bǔ)菌株構(gòu)建及鑒定
　　1.構(gòu)建由乙酰胺啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)devR的重組BCG菌株
　　利用PJV53質(zhì)粒和Pcherry3質(zhì)粒及目的基因，構(gòu)建乙酰胺啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)devR的重組載體，電轉(zhuǎn)化入devR敲除的BCG菌株感受態(tài)中，經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定正確后，命名此重組菌株為devR回補(bǔ)菌

3、株(Pcherry3-Acetamindase-devR)。
　　2.重組BCG菌株P(guān)cherry3-Acetamindase-devR生長(zhǎng)特性的觀察
　　將 BCG野生菌株、devR敲除菌株和devR回補(bǔ)菌株分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即 OD600=0.6時(shí)，調(diào)整菌量至105 CFU/mL，以菌液和培養(yǎng)基比例為1:50接種至含有各自抗生素抗性的7H9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在第1-14 d測(cè)定OD600值，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯

4、示，devR敲除菌株在早期(2～10 d)生長(zhǎng)較BCG野生菌株明顯加快(P<0.01)；devR回補(bǔ)菌株和BCG野生菌株之間的生長(zhǎng)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　3.三種菌株對(duì)異煙肼和利福平的耐藥發(fā)生率檢測(cè)
　　將BCG野生菌株、devR敲除菌株和devR回補(bǔ)菌株以1個(gè)McFarland濃度接種到分別含有10倍MIC濃度的異煙肼和利福平的7H10固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)28天，計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出的菌落數(shù)，得到耐藥發(fā)生率。結(jié)果顯示

5、，三種菌株對(duì)異煙肼和利福平的耐藥發(fā)生率均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　二、三種菌株分別感染上皮細(xì)胞A549和巨噬細(xì)胞Raw264.7的細(xì)胞毒性檢測(cè)
　　三種菌株均以感染復(fù)數(shù)(MOI)等于10∶1分別感染上皮細(xì)胞 A549巨噬細(xì)胞Raw264.7，分別采用流式細(xì)胞儀和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)于0、24、48、72 h測(cè)定細(xì)胞凋亡率和乳酸脫氫酶(LDH)釋放水平；采用RT-PCR方法測(cè)定凋亡相關(guān)基因bcl-2和bad的表達(dá)。

6、>　　細(xì)胞感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，devR敲除菌株感染A549細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡和壞死效應(yīng)明顯增加，相較于 BCG野生菌株和devR回補(bǔ)菌株差異顯著(P<0.05)；三種菌株感染A549細(xì)胞均導(dǎo)致凋亡相關(guān)基因bcl-2表達(dá)升高，并且devR敲除菌株感染組明顯高于 BCG和devR回補(bǔ)菌株感染組(P<0.05)；三種菌株感染Raw264.7細(xì)胞均導(dǎo)致凋亡相關(guān)基因bad表達(dá)升高，并且devR敲除菌株感染組明顯高于BCG野生菌