幽門螺桿菌和結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目前，抗生素的耐藥性日益嚴(yán)重。抗生素耐藥作為一種不可避免的自然現(xiàn)象而存在，社會(huì)因素和人為因素加速了耐藥菌的發(fā)展與傳播。全球各國(guó)耐抗生素感染發(fā)病率的上升使一度可以治療的疾病難以治愈。細(xì)菌耐藥性主要由細(xì)菌自身因素和外界環(huán)境兩方面引起，包括抗生素的濫用、活化酶的產(chǎn)生、抗生素的泵出、藥物作用靶位的改變、耐藥菌的傳播和變遷等。
　　幽門螺桿菌（H.pylori）是慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍的主要病因，并與胃癌、胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤的發(fā)

2、生密切相關(guān)。WHO已將幽門螺桿菌列為第一類致癌因子，我國(guó)人口感染率約為50-70％。因此，抗幽門螺桿菌感染的控制和治療是我們面臨的重要醫(yī)療和社會(huì)問(wèn)題。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，H.pylori對(duì)這些抗生素的耐藥率亦呈逐年上升的趨勢(shì)。對(duì)于耐藥基因的鑒定，長(zhǎng)期以來(lái)多以藥靶基因和藥物代謝相關(guān)基因的分析為主，如：H.pylori已確定耐甲硝唑的主要原因是rdxA或frxA基因的突變；克拉霉素的耐藥與23SrRNA基因點(diǎn)突變有關(guān)。但是，耐藥相關(guān)基因遠(yuǎn)

3、不止這些，并且存在其它的耐藥機(jī)制。因此，需要尋找新的耐藥性分析的方法。
　　信號(hào)標(biāo)簽突變技術(shù)（STM）是一種已經(jīng)成熟應(yīng)用于病原微生物的功能基因篩選技術(shù)，它是通過(guò)用病原體全基因組隨機(jī)插入的突變體在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行高通量篩選。其基本原理是用帶有不同標(biāo)簽的載體分別構(gòu)建突變株文庫(kù)，取不同文庫(kù)中的突變株，混合感染動(dòng)物、細(xì)胞等模型，一定時(shí)間后，由于失去耐受環(huán)境能力或致病能力的突變株死亡，從而在回收樣本中將不能發(fā)現(xiàn)其所攜帶的標(biāo)簽，即取感染灶中的細(xì)菌

4、DNA，與該標(biāo)簽探針雜交將呈陰性反應(yīng)，從而說(shuō)明該突變株中被突變的基因是致病或特定功能相關(guān)基因。高通量篩選方法是篩選鑒定致病相關(guān)基因、耐藥相關(guān)基因以及特定功能相關(guān)基因的有效方法。
　　在本實(shí)驗(yàn)中，我們用4種平末端限制性內(nèi)切酶酶切H.pylori基因組DNA,獲得300～500bp的隨機(jī)片段，克隆入帶有不同標(biāo)簽的自殺質(zhì)粒，經(jīng)電轉(zhuǎn)化E.coliDH5a，以抗生素篩選獲得約1200個(gè)重組質(zhì)粒。該方法中插入片段覆蓋了基因組大量的隨機(jī)序列，為

5、進(jìn)一步大規(guī)模構(gòu)建H.pylori突變體文庫(kù)和鑒定其耐藥相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。
　　結(jié)核分枝桿菌感染引起的結(jié)核病，是威脅人類健康的重要傳染性疾病之一。全世界有近1/3的人感染MTB，近年來(lái)結(jié)核病的發(fā)病率和耐藥率明顯升高，成為21世紀(jì)嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。因此，臨床分子流行病學(xué)的研究分析中，對(duì)MTB進(jìn)行DNA指紋圖譜分析，使我們對(duì)MTB基因水平的遺傳多樣性有了更深的了解，對(duì)傳染病學(xué)機(jī)理和耐藥性分析及傳播很有價(jià)值。通過(guò)

6、檢測(cè)耐藥頻發(fā)基因型菌株的出現(xiàn)和傳播，可早期識(shí)別并控制耐藥株在人群中的傳播。
　　DNA指紋分析技術(shù)自1983年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在醫(yī)學(xué)、法律學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，目前已應(yīng)用于臨床分子流行病學(xué)的研究分析中。IS6110-RFLP分型技術(shù)是MTB基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，主要是通過(guò)檢測(cè)插入片段IS6110產(chǎn)生的變異對(duì)菌株進(jìn)行分型。rep-PCR的原理是擴(kuò)增細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列，通過(guò)電泳條帶比較分析，揭示基因組間的差異。
　　本研究通過(guò)對(duì)

7、85株結(jié)核臨床耐藥分離株的基因組DNA提取，進(jìn)行rep-PCR擴(kuò)增，用Agilent2100生物分析儀分離DNA片段，最后使用DiversiLab軟件分析數(shù)據(jù)，以相似性cutoff值為70％將其分為4個(gè)基因型。結(jié)果顯示不同耐藥菌株基因組間存在遺傳差異，揭示MTB基因型與耐藥間無(wú)明顯相關(guān)性，提示結(jié)核分枝桿菌的耐藥性產(chǎn)生基礎(chǔ)廣泛，各種基因型菌株均普遍容易產(chǎn)生耐藥性。同時(shí)I型和II型結(jié)核分枝桿菌是主要的流行菌株。這一結(jié)論為耐藥結(jié)核分枝桿菌的全