副結(jié)核分枝桿菌hsp65基因的克隆、表達(dá)與免疫研究.pdf

1、副結(jié)核病(Paratuberculosis)是由副結(jié)核分枝桿菌即禽分枝桿菌副結(jié)核亞種(Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis，MAP)引起的一種以反芻動(dòng)物為主要宿主的慢性增生性、頑固性腸炎和進(jìn)行性消瘦為特征的傳染病，也稱(chēng)Johne’s病。該病不僅使病畜的飼料報(bào)酬降低，產(chǎn)奶量和繁殖力下降，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且還與人類(lèi)的克隆氏(Crohn's)病存在潛在聯(lián)系，因此，愈來(lái)愈受到世界各國(guó)的廣泛

2、關(guān)注。目前，該病尚無(wú)經(jīng)濟(jì)有效的治療藥物，控制該病的主要措施是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和消除傳染源，即以變態(tài)反應(yīng)、ELISA、病原分離鑒定等方法進(jìn)行檢疫，對(duì)檢出的陽(yáng)性牛隔離與淘汰。此外，也可采用預(yù)防接種的方法來(lái)控制該病，即將MAP滅活或致弱后制成疫苗進(jìn)行免疫，接種疫苗不僅使該病的臨床型病例減少90％，而且減少了亞臨床感染動(dòng)物的數(shù)量和組織學(xué)或細(xì)菌學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性的病例。但是，菌苗接種后會(huì)干擾該病和結(jié)核病的變態(tài)反應(yīng)和血清學(xué)檢測(cè)，許多國(guó)家已經(jīng)禁止使用接種菌苗來(lái)控

3、制副結(jié)核病。因此，研究開(kāi)發(fā)副結(jié)核病的新型疫苗勢(shì)在必行。 熱休克蛋白(HSPs)是生物體受到物理、化學(xué)、生物、精神等刺激時(shí)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而合成的高度保守的蛋白質(zhì)。根據(jù)分子量，將主要的熱休克蛋白分為5個(gè)家族：大分子量家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和小分子量家族。Hsp60作為一種分子伴侶，能協(xié)助變性、不可溶的凝聚蛋白重新恢復(fù)天然構(gòu)象，在許多病原體傳染過(guò)程中是免疫優(yōu)勢(shì)抗原。hsp65基因又名groEL2基因，其編碼

4、的蛋白是HSP60家族成員，不僅可作為分枝桿菌的主要保護(hù)性抗原，還具有幫助樹(shù)突狀細(xì)胞遞呈抗原等功能。Hsp10(GroES)作為輔分子伴侶，在GroLS指導(dǎo)蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中具有輔助其活性的作用，同時(shí)作為一種有效的T細(xì)胞抗原，能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，使外周血單核細(xì)胞出現(xiàn)增殖反應(yīng)并產(chǎn)生IFN-γ，是制備新型疫苗的候選抗原。 為了研發(fā)預(yù)防副結(jié)核病的新型疫苗尤其是DNA疫苗及相關(guān)蛋白功能，本研究選擇了MAP的主要保護(hù)性抗原Hs

5、p65蛋白，以副結(jié)核分枝桿菌C-2株染色體DNA為模板，以hsp65基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了1626bp的hsp65基因，通過(guò)T-A克隆技術(shù)，將PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T Vector中，以質(zhì)粒大小、酶切分析、PCR擴(kuò)增及序列分析鑒定重組克隆，成功地構(gòu)建出克隆質(zhì)粒pGEM-T-hsp65，以DNASTAR軟件分析了所克隆基因的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列，結(jié)果表明，所獲得的hsp65基因與GenBank中MAPK-10株

6、該基因核苷酸大小完全一致，兩者核苷酸序列的同源性為99.1％，氨基酸序列的同源性為99.3％，表明該基因在副結(jié)核分枝桿菌中高度保守。進(jìn)一步將pGEM-T-hsp65中的hsp65基因酶切、純化后亞克隆至pET-32a(+)原核表達(dá)系統(tǒng)中，構(gòu)建了高效原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-hsp65，在與之相匹配的E.coli BL21(DE3)表達(dá)菌株中，該質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了76Ku的融合蛋白。經(jīng)免疫印跡分析證實(shí)，該融合蛋白具有與副結(jié)核分枝桿

7、菌多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)的特性。 在上述研究的基礎(chǔ)上，為研究開(kāi)發(fā)MAP主要保護(hù)性基因hsp65的DNA疫苗，將克隆質(zhì)粒p GEM-T-hsp65中的hsp65基因酶切、純化后亞克隆至真核表達(dá)載體pVAX1中，成功構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVAX1-hsp65，并以陽(yáng)離子聚合物基因轉(zhuǎn)染試劑將真核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中，通過(guò)熒光抗體和RT-PCR技術(shù)證實(shí)hsp65基因可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)將pGEM-T-hsp65中

8、的hsp65基因酶切、純化后亞克隆至pVAX1-hsp10中，成功構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pVAX1-hsp65-10。 以pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10重組質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠，同時(shí)設(shè)pVAX1、生理鹽水為對(duì)照組。特異性抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫小鼠體內(nèi)分別產(chǎn)生了針對(duì)Hsp65的特異性抗體，且二價(jià)基因免疫組的抗體水平高于單價(jià)基因。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果顯示，pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10

9、免疫組的淋巴細(xì)胞增殖活性高于生理鹽水對(duì)照組，而pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05)。CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10免疫組CD8+T細(xì)胞水平高于對(duì)照組，尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著水平(P>0.05)，但也表明實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生了較高的以MHCⅠ類(lèi)分子遞呈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，pVAX1-hsp65免疫組的CD4+、CD3+T細(xì)胞數(shù)量明顯高

10、于其它組。重組質(zhì)粒pVAX1-hsp65-10免疫組小鼠的IFN-γ水平明顯高于對(duì)照組，pVAX1-hsp65免疫組的小鼠IFN-γ水平略高于對(duì)照組，均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著水平(P>0.05)，但結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10均使免疫小鼠產(chǎn)生了細(xì)胞免疫，而且二價(jià)基因的免疫效果優(yōu)于單價(jià)基因。 以pVAX1-hsp65和pVAX1-hsp65-10免疫豚鼠，同時(shí)設(shè)pVAX1和副結(jié)核分枝桿菌超聲