空泡形成毒素的生物學特性分析及O78血清型禽大腸桿菌病疫苗的研制.pdf

1、禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic E.coli，APEC)可以導致雞、火雞及其他禽類發(fā)生腸道外疾病，如心包炎、肝周炎、腦膜炎等，甚至引起敗血癥從而急性死亡。7-30日齡雛禽易感，成年家禽亦可發(fā)病。該病發(fā)病率高(3.8％～42.6％)、死亡率高(40％～60％);極少數(shù)惡劣的環(huán)境可導致極高的死亡率(90.3％)，我國禽類養(yǎng)殖業(yè)飽受其害。最近有研究表明，APEC亦可引起人類及哺乳動物發(fā)病，甚至死亡。目前多數(shù)養(yǎng)殖廠主要通過添

2、加大量抗生素防控該病，然而由于半個多世紀廣泛應用抗生素，APEC已經(jīng)演化出多種血清型的耐藥性菌株，這使得人們承受著巨大的壓力。
　　本研究根據(jù)NCBI公布的序列，分別設計了18對、14對引物用以檢測毒力基因及耐藥基因的分布情況;同時對菌株的藥物敏感性、生物被膜形成能力、致病性及血清型分布進行檢測。毒力基因檢測結果顯示，分離株的fimC、mat、ibeB、yijp及ompA五種毒力基因的檢出率分別為98％、96％、96％、90％、9

3、0％為APEC的保守性基因，vat和papC檢出率僅為32％和10％。耐藥基因檢測結果顯示，氨基糖苷類、磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類抗生素的抗性基因strA、strB、dhps、sulⅡ及parC檢出率分別為98％、98％、100％、98％及100％，β-內酰胺類抗性基因oxa1、oxa5及oxa31檢出率分別為0％、0％及4％。藥敏試驗結果顯示，所有APEC對四環(huán)素、克林霉素及利福平抗生素100％耐受，對頭孢菌素類的菌必治耐藥性最低僅為

4、16％，對酰胺類的氯霉素耐受率其次為34％;大環(huán)內酯類的紅霉素及阿奇霉素耐藥率分別為90％、82％，喹若酮類的氟哌酸抗生素耐藥率為82％，頭孢菌素類的頭孢噻分耐藥率為84％。APEC分離株的多重耐藥比較嚴重，66％分離株同時耐受10種抗生素，4％ APEC分離株耐受本次檢測的所有類型抗生素，表明APEC廣泛耐藥且存在交叉耐藥現(xiàn)象。生物被膜形成能力檢測結果顯示，APEC分離株的生物被膜形成能力均較弱。血清型分型結果顯示，O78血清型為主要

5、血清型，該群對10日齡櫻桃谷鴨致病性差異較大;
　　APEC的致病機理在于APEC首先利用黏附相關因子與宿主細胞表面特異性受體結合從而定殖于特定宿主細胞表面，然后通過侵襲相關毒力因子侵襲宿主細胞，繼而進入血液循環(huán)系統(tǒng)擴散至各臟器，并在多種毒力因子的共同參與下導致宿主發(fā)病。空泡轉運毒素（Vacuolating autotransporter toxin，Vat）是APEC的重要毒力因子之一，該蛋白屬于V型分泌系統(tǒng)(T5SS)，其可通

6、過其自身的特異性結構直接分泌到膜外。本研究通過采用Red同源重組的方法構建vat缺失株，比較野生株、vat缺失株與互補株在生長特性、凝集沉淀能力、運動性、生物被膜形成能力、致病性等生物學特性的差異。結果表明，該基因能夠抑制APEC泳動能力以及凝集能力，對生物被膜形成、體內存活、致病性具有促進作用，但不影響生長速度、環(huán)境耐受力以及黏附入侵能力。
　　防控禽大腸桿菌病始終堅持防重于治，因此開發(fā)高效、安全的疫苗迫在眉睫。國內研究表明AP

7、EC血清型眾多，因此開發(fā)各地區(qū)的主要血清型的多價苗是一個不錯的選擇。我們先前的研究表明江蘇、安徽周邊地區(qū)流行的O78血清型約占64％，為主要血清型，其次為O2、O1血清型，因此對O78血清型APEC的滅活苗進行研究。結果表明，選取的O78血清型菌株APCE94制備的油乳劑滅活苗對同源血清型強毒株具有很好的保護性，該菌株制備的疫苗以5×108 CFU/只免疫雛鴨，僅首免即可提供至少90％的保護率，首免14d血清效價達到1∶400，二免10