空泡形成毒素的生物學(xué)特性分析及O78血清型禽大腸桿菌病疫苗的研制.pdf

1、禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic E.coli，APEC)可以導(dǎo)致雞、火雞及其他禽類發(fā)生腸道外疾病，如心包炎、肝周炎、腦膜炎等，甚至引起敗血癥從而急性死亡。7-30日齡雛禽易感，成年家禽亦可發(fā)病。該病發(fā)病率高(3.8％～42.6％)、死亡率高(40％～60％);極少數(shù)惡劣的環(huán)境可導(dǎo)致極高的死亡率(90.3％)，我國禽類養(yǎng)殖業(yè)飽受其害。最近有研究表明，APEC亦可引起人類及哺乳動(dòng)物發(fā)病，甚至死亡。目前多數(shù)養(yǎng)殖廠主要通過添

2、加大量抗生素防控該病，然而由于半個(gè)多世紀(jì)廣泛應(yīng)用抗生素，APEC已經(jīng)演化出多種血清型的耐藥性菌株，這使得人們承受著巨大的壓力。
　　本研究根據(jù)NCBI公布的序列，分別設(shè)計(jì)了18對、14對引物用以檢測毒力基因及耐藥基因的分布情況;同時(shí)對菌株的藥物敏感性、生物被膜形成能力、致病性及血清型分布進(jìn)行檢測。毒力基因檢測結(jié)果顯示，分離株的fimC、mat、ibeB、yijp及ompA五種毒力基因的檢出率分別為98％、96％、96％、90％、9

3、0％為APEC的保守性基因，vat和papC檢出率僅為32％和10％。耐藥基因檢測結(jié)果顯示，氨基糖苷類、磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類抗生素的抗性基因strA、strB、dhps、sulⅡ及parC檢出率分別為98％、98％、100％、98％及100％，β-內(nèi)酰胺類抗性基因oxa1、oxa5及oxa31檢出率分別為0％、0％及4％。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有APEC對四環(huán)素、克林霉素及利福平抗生素100％耐受，對頭孢菌素類的菌必治耐藥性最低僅為

4、16％，對酰胺類的氯霉素耐受率其次為34％;大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素及阿奇霉素耐藥率分別為90％、82％，喹若酮類的氟哌酸抗生素耐藥率為82％，頭孢菌素類的頭孢噻分耐藥率為84％。APEC分離株的多重耐藥比較嚴(yán)重，66％分離株同時(shí)耐受10種抗生素，4％ APEC分離株耐受本次檢測的所有類型抗生素，表明APEC廣泛耐藥且存在交叉耐藥現(xiàn)象。生物被膜形成能力檢測結(jié)果顯示，APEC分離株的生物被膜形成能力均較弱。血清型分型結(jié)果顯示，O78血清型為主要

5、血清型，該群對10日齡櫻桃谷鴨致病性差異較大;
　　APEC的致病機(jī)理在于APEC首先利用黏附相關(guān)因子與宿主細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合從而定殖于特定宿主細(xì)胞表面，然后通過侵襲相關(guān)毒力因子侵襲宿主細(xì)胞，繼而進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)擴(kuò)散至各臟器，并在多種毒力因子的共同參與下導(dǎo)致宿主發(fā)病。空泡轉(zhuǎn)運(yùn)毒素（Vacuolating autotransporter toxin，Vat）是APEC的重要毒力因子之一，該蛋白屬于V型分泌系統(tǒng)(T5SS)，其可通

6、過其自身的特異性結(jié)構(gòu)直接分泌到膜外。本研究通過采用Red同源重組的方法構(gòu)建vat缺失株，比較野生株、vat缺失株與互補(bǔ)株在生長特性、凝集沉淀能力、運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成能力、致病性等生物學(xué)特性的差異。結(jié)果表明，該基因能夠抑制APEC泳動(dòng)能力以及凝集能力，對生物被膜形成、體內(nèi)存活、致病性具有促進(jìn)作用，但不影響生長速度、環(huán)境耐受力以及黏附入侵能力。
　　防控禽大腸桿菌病始終堅(jiān)持防重于治，因此開發(fā)高效、安全的疫苗迫在眉睫。國內(nèi)研究表明AP

7、EC血清型眾多，因此開發(fā)各地區(qū)的主要血清型的多價(jià)苗是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。我們先前的研究表明江蘇、安徽周邊地區(qū)流行的O78血清型約占64％，為主要血清型，其次為O2、O1血清型，因此對O78血清型APEC的滅活苗進(jìn)行研究。結(jié)果表明，選取的O78血清型菌株APCE94制備的油乳劑滅活苗對同源血清型強(qiáng)毒株具有很好的保護(hù)性，該菌株制備的疫苗以5×108 CFU/只免疫雛鴨，僅首免即可提供至少90％的保護(hù)率，首免14d血清效價(jià)達(dá)到1∶400，二免10