禽病原性大腸桿菌E058株iucC、iutA基因突變株的構建及其生物學特性.pdf

1、禽大腸桿菌病是由禽病原性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli，APEC)引起的一種常見而重要的細菌性傳染病，且易與其它病原性細菌、病毒并發(fā)或繼發(fā)，給世界范圍內(nèi)的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。
　　 鐵是細菌代謝必須的營養(yǎng)因子，細菌生長所需鐵(離子)濃度約為10-7mol/L，病原性大腸桿菌天然形成了特定的利用鐵元素的系統(tǒng)(specific iron assimilationsystem)，W

2、illiams最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了這一系統(tǒng)，這一系統(tǒng)由嗜鐵體(sideroohore)、氣桿菌素(aerobactin)的合成和氣桿菌素特定的外膜蛋白受體(由iutA編碼)的表達兩部分組成。細菌的這兩種成分在鐵饑餓(iron starvation)的情況下，均能得到強烈誘導表達。流行病學調(diào)查表明，氣桿菌素相關基因只存在于有毒力菌株，在無毒力菌株中未發(fā)現(xiàn)。氣桿菌素是由5個基因編碼的，它們共處于一個操縱子，其中參與氣桿菌素的合成是iucA

3、、iucB、iucC和iucD4個基因，第五個基因iutA編碼一種膜蛋白受體。本研究旨在探討編碼氣桿菌素家族的iucC、iutA基因與APEC致病性之間的關系，了解APEC iucC與iutA基因突變株的生物學特性，為揭示APEC的致病機理和特異性防治措施奠定基礎。
　　 本研究運用等位基因交換的方法構建iucC、iutA的單基因和雙基因缺失突變株。PCR擴增帶有酶切位點的iucC、iutA基因并將其插入到pBSK載體多克隆位點

4、中相應酶切位點處，再運用分子克隆的方法將Zeocin抗性基因和Kanamycin抗性基因分別插入到目的基因iucC和iutA中，構建出帶Zeocin抗性基因標志的載體pS-iucC-Zeo和帶Kanamycin抗性基因標志的載體pS-iutA-Kan。PCR擴增片段iucC-Zeo和iutA-Kan，并電轉(zhuǎn)化入帶有質(zhì)粒pKD46的禽病原性大腸桿菌分離株E058中，在Red重組系統(tǒng)中的質(zhì)粒pKD46表達重組酶的幫助下，篩選出E058株的基

5、因突變株E058iucC及E058iutA，將片段iucC-Zeo電轉(zhuǎn)化入帶有質(zhì)粒pKD46的單突變株E058iutA中，篩選出雙突變株E058iucCiutA。
　　 Southern blot的結(jié)果顯示Zeocin、Kanamycin抗性基因在APEC E058株的基因組中的插入是單拷貝的；RT-PCR結(jié)果表明突變株的iucC、iutA基因不能轉(zhuǎn)錄，而其上下游基因的轉(zhuǎn)錄未受到影響。體外生長曲線的測定結(jié)果表明E058iucC、

6、E058iutA及E058iucCiutA株和E058株在生長速度上幾乎沒有差異；回復拯救突變株E058iucC以及E058iutA，Aerobactin產(chǎn)生試驗結(jié)果顯示突變株E058iucC及E058iucCiutA不能產(chǎn)生Aerobactin，而野生株E058、E058iutA、回復株Re-E058iucC和Re-E058iutA可以產(chǎn)生Aerobactin：提取細菌外膜蛋白(OMPs)，SDS-PAGE結(jié)果表明經(jīng)低鐵環(huán)境誘導后，E

7、058、E058iutA以及回復株Re-E058iutA在74 kDa大小IutA蛋白處沒有差異。E058、E058iucC、E058iutA及E058iucCiutA株的半數(shù)致死量(LD50)分別為104.4、105.0、104.6和105.1CFU，表明突變株的毒力有一定的下降；在體外，E058iucC、E058iutA及E058iucCiutA株與親本株E058的競爭指數(shù)(CI)值分別為1.00，0.96，0.87，結(jié)果表明E05

8、8iutA及E058iucCiutA在體外被輕度致弱，而E058iucC未致弱；在體內(nèi)，攻毒后24 h，E058iutA與親本株E058在雞肝臟的CI值為0.003，脾臟的CI值為0.006，心血的CI值為0.071，腎臟CI值為0.073，肺臟的CI值為0.216，而E058iucC及E058iucCiutA與親本株各臟器的CI值均大于0.1，結(jié)果表明，對大多數(shù)受檢臟器，三個突變株均被輕度致弱，但對于E058iutA，其在肝、脾中被高

9、度致弱，在心血和腎臟中為中度致弱；35日齡SPF雞體內(nèi)動態(tài)分布結(jié)果提示攻毒后24 h，三個突變株在受檢臟器中的細菌數(shù)較APEC E058株均有不同程度的下降，其中，E058iutA、E058iucCiutA在血液和肺臟中有明顯下降。12日齡SPF雞胚的致死性實驗結(jié)果顯示E058組死亡率為90.0％，而E058iucC、E058iutA及E058iucCiutA突變株組死亡率分別為86.7％、83.3％及80％，表明突變株的毒力有一定的下