大腸桿菌腸毒素在酵母菌表面的展示及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、動物腹瀉病是指由細(xì)菌、病毒感染或其他各種因素引起的以急性或慢性腹瀉為主要特征的疾病。該病多發(fā)生于幼齡動物中，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)的健康發(fā)展。而產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic escherichia coil,ETEC）又是動物腹瀉的主要致病因素，ETEC可產(chǎn)生一種或幾種腸毒素，包括熱敏腸毒素（Heat-liable toxin，LT）和耐熱腸毒素（Heat-stable toxin，ST），通過影響腸細(xì)胞壁的透過性，使水和

2、電解質(zhì)流向腸腔，從而導(dǎo)致類似人霍亂的水樣腹瀉的發(fā)生。ST為小分子蛋白，因其具有較好的免疫原性，常被用于疫苗研發(fā)。LT則憑借分子量大、免疫原性強等優(yōu)勢，常被用作黏膜免疫佐劑。
　　微生態(tài)制劑(Probioties)，是指運用微生態(tài)學(xué)原理，將益生菌及其代謝所產(chǎn)生的促生長物質(zhì)進行特殊加工而制成的活菌制劑。畜禽微生態(tài)制劑已經(jīng)逐漸成為社會的研究焦點，因為其有別于化學(xué)物質(zhì)具有無毒副作用（非化學(xué)物質(zhì)）、藥殘檢測無殘留、對抗生素等藥物無耐受能力等

3、優(yōu)點。目前，抗生素的使用已受到嚴(yán)格控制，使微生態(tài)制劑廣泛應(yīng)用于食品，藥品及保健食品等多個領(lǐng)域，且應(yīng)用效果顯著。
　　酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)是一種將外源靶蛋白通過信號肽引導(dǎo)，進而錨定在酵母細(xì)胞表面的真核表達系統(tǒng)。釀酒酵母菌是常用的展示載體。此項技術(shù)具有表達偏差小、展示蛋白種類多、分子數(shù)量大、篩選、純化、活性測定方便等特點。目前，該技術(shù)已應(yīng)用于多個研究領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　近年來，抗生素的過度使用也給動物體和周圍環(huán)境造成

4、較高濃度的獸藥殘留，破壞了水及土壤等生態(tài)環(huán)境。耐藥菌株的出現(xiàn)成為傳統(tǒng)抗生素使用的一大障礙。因而針對特異性靶點設(shè)計安全性好、免疫原性高的新型微生態(tài)制劑已成為當(dāng)前研究的熱點。本課題成功建立了大腸桿菌腸毒素融合蛋白在酵母表面的展示技術(shù)，實驗研究表明，構(gòu)建的釀酒酵母基因工程菌不僅具有微生態(tài)調(diào)節(jié)作用，還可以有效提高機體的黏膜免疫功能，對強毒ETEC的攻擊具有保護作用。
　　1、釀酒酵母表面展示系統(tǒng)的建立。首先，進行ETEC所產(chǎn)生的三種腸毒素

5、estA、estB及eltAB基因的克隆。采用基因定點突變的方法對estA及eltAB基因進行改造，然后以7個氨基酸的linker序列將三種腸毒素基因串聯(lián)。通過雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化等手段成功構(gòu)建pYD1-estA-eltAB-estB重組質(zhì)粒，再經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化的方式成功構(gòu)建了EBY100/pYD1-estA-eltAB-estB釀酒酵母基因工程菌，免疫熒光檢測及掃描電鏡檢測結(jié)果顯示，estA-eltAB-estB融合蛋白成功展示在釀酒酵母菌表

6、面。
　　2、釀酒酵母基因工程菌對大鼠小腸上皮細(xì)胞的影響。選取4-6周齡的SPF級SD大鼠90只，雌雄各半。隨機分為空白對照組、基因工程菌組及EBY100酵母菌組，每組30只。EBY100酵母菌組及基因工程菌組的灌胃濃度為107 CFU/mL，每天灌胃1次，每次2mL/只，空白對照組給予同等體積的生理鹽水，持續(xù)21d。此后連續(xù)3 d灌胃108 CFU/mL大腸桿菌H10407菌液，每日一次，每次4mL/只。分別于灌胃試驗第7d、1

7、4d、21d及灌胃大腸桿菌菌液3d后取所需組織樣本。
　?。?）基因工程菌對小腸絨毛影響。酵母及其基因工程菌的十二指腸寬度極顯著高于空白對照組（P<0.01），且兩實驗組之間無顯著差異（P<0.05）。酵母基因工程菌組的十二指腸、空腸的絨毛寬度極顯著高于空白對照組（P<0.01），十二指腸的V/C值明顯高于EBY100酵母菌組，呈現(xiàn)出極顯著差異（P<0.01），回腸及空腸的隱窩深度則顯著低于于空白對照組（P<0.05），絨毛長度及

8、寬度變大，隱窩深度減小是小腸對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收能力增強的表現(xiàn)，這也進一步證明了釀酒酵母基因工程菌對小腸絨毛的生長促進作用。從灌胃大腸桿菌后的測量結(jié)果可以看出，EBY100釀酒酵母組十二指腸、空腸及回腸的長度及V/C值呈極顯著下降趨勢（P<0.01），隱窩深度呈現(xiàn)明顯上升趨勢，其中空腸的隱窩深度數(shù)值較灌胃前變化最大，呈現(xiàn)出極顯著差異（P<0.01）。EBY100酵母菌組絨毛長度、V/C值及較灌胃大腸桿菌之前極顯著下降（P<0.01），空腸

9、的隱窩深度極顯著上升（P<0.01）。酵母基因工程菌組中空腸及十二指腸絨毛長度則無明顯變化（P>0.05）；在絨毛寬度及隱窩深度方面各長度均表現(xiàn)出無顯著變化（P>0.05）；十二指腸的V/C值較灌胃 ETEC前無顯著差異（P>0.05）。ETEC攻毒后結(jié)果說明，與EBY100酵母菌相比較，酵母基因工程菌對小腸絨毛的保護作用更強。
　　（2）糞便pH值檢測。實驗的0-21d期間，空白組pH值均高于實驗組，并從灌胃的第14d開始，酵母

10、及其基因工程菌組的pH值極顯著低于空白對照組（P<0.01），灌胃21d時差異最顯著（P<0.01）。灌胃ETEC后，空白對照組腸道內(nèi)pH值顯著升高（P<0.05）；EBY100酵母菌組的pH值與灌胃21d相比并無顯著變化（P>0.05）；酵母基因工程菌組的pH值與灌胃21d相比基本無變化（P>0.05）。以上結(jié)果表明，酵母基因工程菌在維持腸道內(nèi)酸堿平衡方面發(fā)揮了作用。
　?。?）大鼠腸道菌群的變化分析。從灌胃的第14d開始，各實

11、驗組腸道菌群的數(shù)量開始顯著增長，21d天時呈現(xiàn)出極顯著差異（P<0.01）。其中，EBY100酵母菌組除腸球菌外腸道內(nèi)的乳酸菌、雙歧桿菌、梭菌及類桿菌的增長倍數(shù)均最大。當(dāng)灌胃了ETEC后，酵母基因工程菌組大鼠腸道菌群數(shù)量的增長倍數(shù)極顯著高于EBY100酵母菌組（P<0.01），這一結(jié)果也進一步證明了釀酒酵母基因工程菌對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。
　　3、酵母菌及其基因工程菌的實驗動物免疫研究。
　?。?）酵母基因工程菌對大鼠腸黏膜

12、中SIgA含量的影響。灌胃第14d，酵母工程菌組SIgA分泌量最高，與EBY100酵母菌組及空白對照組之間均呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）；灌胃第21d，酵母工程菌組與EBY100酵母菌組均極顯著高于空白組且兩實驗組之間無顯著差異（P>0.05）。ETEC攻毒后空白對照組與實驗組的SIgA的分泌量均極顯著低于攻毒前（P<0.01），但酵母基因工程菌組減少的幅度最小，這說明酵母基因工程菌提高了小腸黏膜的免疫功能。
　?。?）酵母基因

13、工程菌對大鼠腸黏膜中細(xì)胞因子的影響。在實驗初期，各實驗組腸黏膜IL-2、IL-4及IFN-γ三種細(xì)胞因子含量均未發(fā)生顯著變化，從灌胃第14d開始，EBY100酵母菌組及基因工程菌組各細(xì)胞因子含量顯著上升（P<0.05）；第21d時，呈現(xiàn)極顯著上升趨勢（P<0.01）。灌胃 ETEC后，EBY100酵母菌組及基因工程菌組三種因子的分泌量均極顯著高于21d空白對照組，其中，基因工程菌組IL-2、IL-4分泌量最高，而IFN-γ的分泌量最低，

14、以上結(jié)果表明酵母基因工程菌有效的提高腸黏膜中IL-2、IL-4及IFN-γ的分泌量，從而提高機體免疫力。
　?。?）酵母基因工程菌對大鼠免疫器官的影響。灌胃14d開始空白對照組及兩組實驗組的胸腺及脾臟系數(shù)均有所增加，其中酵母菌組增長幅度最小且明顯低于基因工程菌組。灌胃ETEC后，空白組與酵母菌組數(shù)值均有所下降，而酵母基因工程菌組的數(shù)值并無明顯變化，甚至有微小上升，與空白對照組形成顯著差異（P<0.05）。這一結(jié)果表明，酵母基因工程

15、菌具有促進胸腺及脾臟發(fā)育的功能。
　?。?）酵母基因工程菌對大鼠血清學(xué)指標(biāo)的影響。通過對血清中ALT、AST、TG、TBILI、DBILI、GLU、CHO、ALB及TP含量的檢測可以發(fā)現(xiàn)，在實驗的前21d，各實驗組的各項指標(biāo)的檢測結(jié)果均無顯著變化，但灌胃ETEC后，各組的ALB、TP及GLU值均呈現(xiàn)上升趨勢，但均未達到顯著水平。其中，酵母基因工程菌組上升幅度最小，這一結(jié)果表明，酵母基因工程菌沒有引起肝組織的損傷及血液其他指標(biāo)的改變

16、。
　　綜上所述，得出以下結(jié)論：
　　1、成功建立了大腸桿菌腸毒素在釀酒酵母表面的展示技術(shù)，動物實驗證明，所構(gòu)建的工程菌對大鼠安全、無毒副作用。
　　2、釀酒酵母基因工程菌能有效降低攻毒ETEC后的大鼠腸道pH值，可以維持腸道內(nèi)酸堿平衡。
　　3、工程菌能夠調(diào)節(jié)大鼠腸道微生態(tài)的動態(tài)平衡，使腸道菌群數(shù)量呈極顯著上升趨勢；ETEC攻毒后工程菌發(fā)揮酵母菌的益生作用，使腸道菌群數(shù)量依然實現(xiàn)穩(wěn)定增長。
　　4、工程菌