禽病原性大腸桿菌的生物學(xué)特性及其可能毒力相關(guān)基因的鑒定.pdf

1、禽大腸桿菌病(AvianColibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大腸桿菌(AvianPathogenicEscherichiacoli,APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病，包括大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌肉芽腫(hjarre氏病)、氣囊病(慢性呼吸道病，CRD)、禽蜂窩織炎、腫頭綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及臍炎/卵黃囊感染。禽大腸桿菌病是2至12周齡雞和火雞的一種常見傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失

2、。 1.我國(guó)部分地區(qū)禽源大腸桿菌的分離與鑒定 從我國(guó)20個(gè)省、市、自治區(qū)臨診上典型大腸桿菌病病變的病、死家禽中分離到大腸桿菌1351株，通過玻板凝集和試管凝集試驗(yàn)，除236株未能定型、28株自凝外，測(cè)定出1087個(gè)分離株的血清型，這些分離株覆蓋了101個(gè)血清型，其中以O(shè)78、O2、O18、O36、O1、O4、O107、O11、O15、O88、O127、O14、O6、O26、O138、O91、O9、O60和O131等19個(gè)

3、血清型為主，占定型菌株的74.3％(808/1087)，為我國(guó)部分地區(qū)禽源大腸桿菌的常見血清型，其中O78血清型分離株占定型菌株的24.9％(271/1087)，為禽源大腸桿菌最主要的血清型。同時(shí)這19個(gè)血清型也是健康家禽泄殖腔分離株的重要血清型，占分離株的42.0％(55/131)，但臨床分離株比泄殖腔分離株在這19個(gè)血清型間的出現(xiàn)頻率高，差異極顯著(P＜0.01)，而且O14、O18、O36、O60和O138等5個(gè)血清型幾乎只出現(xiàn)于

4、臨床分離株中，而在泄殖腔樣品所分離到的大腸桿菌中很少見。與臨床分離株相比，泄殖腔分離株的O6、O9和O107血清型的出現(xiàn)頻率明顯較高，差異極顯著(P＜0.01)。 2.抑制差減雜交篩選禽病原性大腸桿菌基因組差異片段及其分析采用抑制差減雜交技術(shù)(suppressionsubtractivehybridization，SSH)對(duì)禽病原性大腸桿菌高致病株E037(血清型O78)與非致病菌株K-12MG1655以及同一O2血清型

5、高致病菌株E058與低致病菌株E526進(jìn)行基因組差異片段克隆與分析。從E037株中共檢出17個(gè)特異性差異片段，其大小為180-1519bp，G+C含量為31.8％-58.5％，E058株中共檢出32個(gè)特異性差異片段，其大小為216-1201bp，G+C含量為34.6％-56.1％。經(jīng)同源分析，這些序列可分為4類：質(zhì)粒相關(guān)序列、噬菌體相關(guān)序列、已知功能序列、未知功能序列。這些差異片段包含許多重要的大腸桿菌毒力相關(guān)因子，如大腸桿菌素、氣桿菌

6、素(aerobactin)受體、血清耐受因子、鐵系統(tǒng)(irosystem)等。從禽病原性大腸桿菌中獲得的49個(gè)片段中，有14個(gè)片段與其它微生物基因組同源性較高。結(jié)果表明，大腸桿菌高致病菌株與低致病菌株或非致病菌株基因組間存在較多差異基因，其中包括毒力基因、毒力相關(guān)基因、代謝以及噬菌體等基因成分。 3.選擇性捕獲禽病原性大腸桿菌體內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列 采用選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列(selectivecaptureoftranscribed

7、sequences，SCOTS)方法鑒定禽病原性大腸桿菌E037株(血清型O78)在感染SPF雞過程中的細(xì)菌表達(dá)基因。通過總RNA分離、cDNAs合成、PCR擴(kuò)增、SCOTS對(duì)cDNAs選擇和致病性特異(non-E.coliK-12)轉(zhuǎn)錄序列的富集，致病性特異的cDNAs被分離鑒定，共獲得31個(gè)轉(zhuǎn)錄序列(命名為aec)，其中分別有2、1、4、14、2和8個(gè)aec序列與黏附素、LPS的合成、鐵的攝取系統(tǒng)、質(zhì)粒編碼基因、噬菌體編碼基因和一些

8、其它功能基因相關(guān)；從氣囊中分離到16個(gè)aec序列，心包膜15個(gè)aec序列；有3種與質(zhì)粒編碼基因相關(guān)序列在氣囊和心包膜中都被分離到。結(jié)果顯示APEC致病性特異序列包括黏附素、LPS的合成、鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)、質(zhì)粒編碼基因、噬菌體編碼基因和一些其它功能基因等。通過SCOTS方法建立了一種體內(nèi)表達(dá)致病性特異基因的方法和APEC在自然宿主感染模型中致病性相關(guān)基因的表達(dá)譜。 4.禽病原性大腸桿菌基因突變株的構(gòu)建和功能鑒定 運(yùn)用基因重組方法分

9、別將綠色熒光蛋白(EGFP)和慶大霉素抗性基因(gentamycin，GM)連接到PCR擴(kuò)增的iro、tsh兩端區(qū)域產(chǎn)生的2個(gè)目的基因片段之間，并分別插入到pUC18載體的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建出帶EGFP和GM標(biāo)志的載體pUC18-iroBNEGFP和pUC18-tshFRGM，分別用BamHⅠ和SphⅠ從中切下上述3個(gè)片段，再將之克隆到pMEG-375自殺性載體的BamHⅠ和SphⅠ位點(diǎn)中，分別構(gòu)建成自殺性載體pMEG375-iroBN

10、EGFP和pMEG375-tshFRGM，將突變載體轉(zhuǎn)化到受體APECE037株中，根據(jù)同源重組原理，分別篩選出E037基因缺失突變株E037(△iro)、E037(△tsh)和E037(△iro△tsh)。E037、E037(△iro)、E037(△tsh)和E037(△iro△tsh)株的LD50分別為105.6CFU、108.4CFU、109.0CFU和109.5CFU，動(dòng)物感染性實(shí)驗(yàn)表明E037(△iro)、E037(△tsh)

11、和E037(△iro△tsh)突變株在內(nèi)臟器官和血液中的感染能力和大腸桿菌病變均有了明顯下降，鐵系統(tǒng)和溫度敏感性血凝素在APECE037株的致病性和持續(xù)感染中發(fā)揮重要的作用，但兩個(gè)基因間的致病協(xié)同能力不明顯。在243株APEC中，有205株為iro+菌株，其中高致病株、中等致病株和低致病株分別為89.8％(184/205)、8.8％(18/205)和1.5％(3/205)；有167株為tsh+菌株，其中高致病株、中等致病株和低致病株分別

12、為87.4％(146/167)、12.6％(21/167)和0％(0/167)。結(jié)果顯示鐵系統(tǒng)和溫度敏感性血凝素為APEC重要的致病因子。 5.禽源大腸桿菌可能的毒力因子在致病性中的作用及其生物學(xué)特性 為了了解毒力相關(guān)基因在禽病原性大腸桿菌中的分布和出現(xiàn)頻率，本試驗(yàn)對(duì)243個(gè)分離株的iucD、tsh、iro、irp2、fyuA、ler、eaeA、fimH、papC、felA、kpsⅡ、cvaC和iss等13個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)

13、，各基因的檢測(cè)率分別為66.7％、68.7％、84.4％、67.1％、67.1％、0.4％、0.4％、95.9％、28.0％、19.3％、79.4％、60.5％和20.8％，通過與分離株的致病性進(jìn)行分析比較，結(jié)果顯示在高致病株與低致病株中出現(xiàn)頻率差異顯著(P＜0.05)的基因有iucD、tsh、iro、irp2、fyuA、iss和cvaC，這些基因與APEC致病性呈一定的相關(guān)性。在不同致病株之間出現(xiàn)頻率差異顯著(P＜0.05)的iucD

14、、tsh、iro、iss、cvaC和HPI這6個(gè)毒力相關(guān)因子中，2個(gè)毒力相關(guān)因子組合的出現(xiàn)頻率為42.8％-72.8％，3個(gè)毒力相關(guān)因子組合的出現(xiàn)頻率為39.9％-60.5％，其中tsh+iro+iss、iro+iss+HPI、iucD+tsh+iro、tsh+iro+HPI和iucD+tsh+iss的出現(xiàn)頻率分別為：60.5％、58.8％、55.6％、54.3％和52.7％。在這些分離株中，高度血清耐受、中等血清耐受、輕度血清耐受和血

15、清敏感菌株分別占受試菌株的57.2％(139/243)、28.8％(70/243)、10.3％(25/243)和3.7％(9/243)。在167株tsh+菌株溫度敏感性血凝素試驗(yàn)中，MRHA菌株為112株，占tsh+菌株的67.1％。在表達(dá)Tsh的菌株中，O1、O2和O78血清型的高致病株占所在血清型分離株的83％-100％，而其它血清型的高致病株僅占57％左右，差異顯著(P＜0.05)。結(jié)果表明禽源大腸桿菌的致病性與其血清耐受、雞紅細(xì)

16、胞MSHA菌毛的表達(dá)和溫度敏感性血凝素的表達(dá)呈一定的相關(guān)關(guān)系。 綜上所述，在國(guó)內(nèi)有關(guān)禽大腸桿菌病的流行病學(xué)研究中，本研究收集的菌株范圍廣、菌株多、鑒定系統(tǒng)。本次調(diào)查菌株的血清型種類達(dá)101個(gè)之多，其中以O(shè)78、O2、O18、O36、O1、O4、O107、O11、O15、O88、O127、O14、O6、O26、O138、O91、O9、O60和O131為等19個(gè)血清型為主，證實(shí)了O1、O2和O78血清型大腸桿菌同樣為我國(guó)部分地區(qū)最為

17、常見的血清型，但同時(shí)O抗原的多樣性趨勢(shì)日益明顯，顯示我國(guó)的禽大腸桿菌病比國(guó)外更為復(fù)雜；且96％以上分離株具高、中等致病性；成功地運(yùn)用了禽病原性大腸桿菌SSH和SCOTS方法；運(yùn)用自殺性載體，成功構(gòu)建了APECE037株的3個(gè)基因缺失突變株，證明鐵系統(tǒng)和溫度敏感性血凝素是APEC的重要的致病因子，可作為禽源大腸桿菌致病基因的分子標(biāo)記；APEC的致病性與一定的病原生物學(xué)特性關(guān)聯(lián)，即致病性越高，iucD、tsh、iro、irp2、fyuA、i